Duplex-Specific Nuclease를 활용한 miRNA 신호 증폭 검출 기술

miRNA는 길이가 짧고 양이 적어 직접 검출하기 까다로운 핵산입니다. Duplex-Specific Nuclease를 이용하면 표적 miRNA와 결합한 DNA probe를 선택적으로 절단하고 miRNA는 다시 반응에 참여하도록 만들어 하나의 표적에서 반복적인 신호를 생성할 수 있습니다.

miRNA는 왜 직접 검출하기 어려울까?

miRNA는 일반적으로 약 18~24 nucleotide 길이의 짧은 non-coding RNA입니다.

Gene expression regulation에 관여하며 특정 miRNA의 발현량 변화가 여러 생물학적 상태와 연관될 수 있어 biomarker 연구에서도 많이 다뤄집니다.

하지만 분석 대상으로 보면 몇 가지 어려움이 있습니다.

우선 길이가 짧기 때문에 긴 DNA나 mRNA처럼 여러 probe가 동시에 결합할 공간이 제한적입니다.

서로 다른 miRNA 사이의 sequence similarity가 높은 경우도 있습니다.

특히 같은 miRNA family에서는 한두 nucleotide만 다른 sequence가 존재할 수 있어 높은 specificity가 요구됩니다.

또한 biological sample에서 특정 miRNA의 농도가 낮다면 단순한 probe hybridization만으로 충분한 signal을 얻기 어려울 수 있습니다.

이러한 문제를 해결하기 위한 방법 가운데 하나가 Duplex-Specific Nuclease, DSN을 이용한 signal amplification입니다.

Duplex-Specific Nuclease란 무엇일까?

DSN은 duplex nucleic acid 구조를 인식해 절단할 수 있는 nuclease입니다.

분자진단 연구에서 특히 활용되는 특징은 DNA-DNA duplex와 DNA-RNA hybrid에서 DNA strand를 절단할 수 있다는 점입니다.

반면 single-stranded nucleic acid에 대한 활성이 상대적으로 낮다는 특성을 이용할 수 있습니다.

따라서 DNA probe를 single-stranded 상태에서는 유지하고 target과 hybridization했을 때 nuclease substrate로 전환되도록 assay를 구성할 수 있습니다.

즉, target recognition 자체가 DSN이 작용할 수 있는 구조를 만드는 과정이 됩니다.

miRNA와 상보적인 DNA Probe를 준비한다

가장 기본적인 DSN 기반 miRNA assay에서는 target miRNA와 상보적인 DNA probe를 사용합니다.

Target이 없을 때 DNA probe는 single-stranded 상태로 존재할 수 있습니다.

이 상태에서는 원하는 DSN cleavage가 제한되도록 조건을 구성합니다.

Target miRNA가 들어오면 DNA probe의 상보적인 sequence와 hybridization합니다.

그러면

DNA Probe + miRNA

에서

DNA-RNA Hybrid

가 형성됩니다.

이 순간 probe의 상태가 달라집니다.

단순한 ssDNA probe가 DSN이 인식할 수 있는 duplex-containing substrate로 변한 것입니다.

DSN은 Hybrid에 포함된 DNA Probe를 절단한다

DNA-RNA hybrid가 만들어지면 DSN이 작용할 수 있습니다.

여기에서 중요한 것은 miRNA 자체를 증폭하기 위해 새로운 RNA를 합성하는 것이 아니라는 점입니다.

DSN은 hybrid에 포함된 DNA probe를 절단하는 방향으로 이용됩니다.

즉,

Target miRNA

→ DNA Probe와 Hybridization

→ DNA-RNA Hybrid 형성

→ DSN Recognition

→ DNA Probe Cleavage

순서로 진행됩니다.

Probe가 절단되면 처음 형성됐던 안정적인 hybrid 구조도 유지되기 어려워집니다.

짧아진 DNA fragment는 target miRNA에서 분리될 수 있습니다.

그러면 miRNA가 다시 자유로운 상태로 돌아옵니다.

절단되지 않은 miRNA가 다시 사용된다

DSN assay에서 signal amplification이 가능한 핵심적인 이유입니다.

처음 반응에 참여했던 target miRNA는 probe cleavage 이후 반드시 소비되는 것이 아닙니다.

방출된 miRNA는 새로운 intact DNA probe와 다시 hybridization할 수 있습니다.

그러면 두 번째 DNA-RNA hybrid가 만들어집니다.

DSN은 다시 DNA probe를 절단합니다.

이후 miRNA가 또 방출됩니다.

반응을 단순화하면 다음과 같습니다.

miRNA + Probe 1

→ Hybrid 1

→ DSN Cleavage

→ miRNA 방출

그리고 다시

miRNA + Probe 2

→ Hybrid 2

→ DSN Cleavage

→ miRNA 방출

과정이 반복됩니다.

하나의 miRNA가 여러 DNA probe의 cleavage를 유도할 수 있는 것입니다.

Target Recycling이 Signal Amplification을 만든다

이 반응에서는 target miRNA의 copy number가 증가하지 않습니다.

처음 존재했던 miRNA가 반복적으로 사용될 뿐입니다.

대신 하나의 miRNA가 여러 개의 probe를 절단할 수 있습니다.

따라서

1 Target → 1 Signal

구조를

1 Target → Multiple Probe Cleavage Events

로 바꿀 수 있습니다.

이를 target recycling amplification으로 이해할 수 있습니다.

PCR처럼 target 자체를 복제하는 방식과 구별되는 부분입니다.

Fluorophore와 Quencher를 이용하면 절단을 확인할 수 있다

DNA probe의 cleavage를 직접 눈으로 확인하기는 어렵습니다.

따라서 DSN reaction을 fluorescence signal과 연결할 수 있습니다.

예를 들어 DNA probe에 fluorophore와 quencher를 배치할 수 있습니다.

Intact probe에서는 fluorophore와 quencher가 가까운 구조를 형성해 fluorescence가 억제되도록 설계합니다.

Target miRNA가 결합하고 DSN이 probe를 절단하면 fluorophore와 quencher를 포함한 fragment가 서로 분리될 수 있습니다.

그러면 quenching이 감소하면서 fluorescence가 증가합니다.

즉,

miRNA Recognition

→ DNA-RNA Hybrid

→ DSN Cleavage

→ Fluorophore-Quencher Separation

→ Fluorescence Increase

로 target 정보를 optical signal로 변환할 수 있습니다.

하나의 miRNA에서 여러 형광 신호가 만들어질 수 있다

단순한 hybridization probe에서는 target 하나가 probe 하나와 결합하는 구조가 일반적입니다.

따라서 target concentration이 매우 낮으면 fluorescence도 작을 수 있습니다.

DSN system에서는 target이 첫 번째 probe의 cleavage를 유도한 뒤 다시 방출됩니다.

같은 miRNA가 두 번째, 세 번째 probe와 계속 반응할 수 있습니다.

각 probe cleavage가 fluorescence 증가로 연결된다면 하나의 target이 여러 signal-generating event를 만들 수 있습니다.

따라서 DSN의 역할은 단순히 DNA를 분해하는 것이 아니라 target recognition을 반복적인 reporter cleavage로 연결하는 것입니다.

Polymerase가 필요하지 않은 Enzymatic Amplification

DSN assay는 enzyme을 사용하므로 enzyme-free amplification은 아닙니다.

하지만 PCR이나 RCA처럼 DNA polymerase를 이용해 새로운 nucleic acid strand를 합성하지도 않습니다.

따라서 증폭 원리가 다릅니다.

PCR에서는

Template → 새로운 DNA Copies

가 생성됩니다.

RCA에서는

Circular Template → 긴 DNA Product

가 만들어집니다.

DSN target recycling에서는

Target → 반복적인 Probe Cleavage

가 발생합니다.

즉, nucleic acid synthesis가 아니라 enzyme-mediated probe turnover를 이용한 signal amplification입니다.

DSN이 Target을 직접 파괴하면 Recycling이 불가능하지 않을까?

DSN 기반 miRNA assay에서는 이 부분이 중요합니다.

Target miRNA가 probe와 함께 빠르게 분해된다면 target recycling이 제대로 일어날 수 없습니다.

따라서 assay는 DNA-RNA hybrid에서 DNA probe가 효과적으로 cleavage되고 RNA target은 재사용될 수 있는 DSN의 substrate preference를 이용합니다.

Probe가 절단된 후 hybrid stability가 감소하면 target miRNA가 product fragment에서 분리됩니다.

방출된 target은 다음 intact probe를 찾아갑니다.

따라서 assay 성능은 단순히 DSN activity가 높다는 사실만으로 결정되지 않습니다.

Hybrid Formation

Selective Probe Cleavage

Product Dissociation

Target Recycling

이 연속적으로 작동해야 amplification이 가능합니다.

Reaction Temperature가 중요한 이유

DSN reaction에서는 nuclease activity뿐 아니라 nucleic acid hybridization도 동시에 고려해야 합니다.

온도가 너무 낮으면 target과 완전히 일치하지 않는 probe도 안정적으로 결합할 가능성이 증가할 수 있습니다.

반대로 지나치게 높은 온도에서는 target-probe hybrid 자체가 안정적으로 형성되지 않을 수 있습니다.

DSN 역시 효율적으로 작동할 수 있는 reaction condition이 존재합니다.

따라서 assay에서는

Probe-Target Hybrid Stability

와

DSN Enzymatic Activity

를 동시에 고려해야 합니다.

이 때문에 단순히 probe sequence만 변경한다고 모든 target에 동일한 조건을 적용할 수 있는 것은 아닙니다.

Single Nucleotide 차이를 구별할 수 있을까?

miRNA 분석에서는 매우 비슷한 sequence를 구별하는 것이 중요할 수 있습니다.

Probe와 target이 완전히 상보적이면 안정적인 DNA-RNA hybrid가 형성될 수 있습니다.

반면 single-base mismatch가 존재하면 hybrid의 thermal stability가 낮아질 수 있습니다.

적절한 reaction condition에서는 perfect-match target이 probe와 안정적으로 결합해 DSN cleavage를 유도하는 동안 mismatch target은 상대적으로 낮은 reaction efficiency를 나타내도록 설계할 수 있습니다.

하지만 single mismatch가 존재한다는 사실만으로 항상 완벽하게 구별되는 것은 아닙니다.

Mismatch의 위치와 염기 조합, probe 길이와 GC content 등이 hybrid stability에 영향을 줍니다.

따라서 miRNA family discrimination이 필요한 경우에는 probe sequence와 reaction temperature를 실험적으로 최적화해야 합니다.

짧은 Probe를 사용한다고 항상 좋은 것은 아니다

miRNA 자체가 짧기 때문에 probe 역시 비교적 짧게 설계될 수 있습니다.

하지만 probe 길이는 assay performance와 직접 연결됩니다.

Probe가 지나치게 짧으면 perfect-match target과도 안정적인 hybrid를 형성하기 어려울 수 있습니다.

반대로 너무 안정적인 probe-target hybrid를 만들면 cleavage 이후 fragment와 target의 dissociation이 느려져 target recycling efficiency가 낮아질 가능성도 있습니다.

따라서 DSN assay에서는 target binding뿐 아니라 cleavage 이후 target이 얼마나 효율적으로 다음 cycle로 이동할 수 있는지도 고려해야 합니다.

DNA Probe의 구조를 바꾸어 Background를 낮출 수 있다

단순한 linear DNA probe 외에도 다양한 구조의 reporter를 DSN과 결합할 수 있습니다.

예를 들어 target이 없을 때 fluorophore와 quencher가 가까운 hairpin probe를 설계할 수 있습니다.

Target이 특정 영역에 결합하면 구조가 변하고 DSN cleavage가 가능한 substrate가 형성됩니다.

이러한 구조를 사용하면 target-independent fluorescence를 낮추면서 target-dependent cleavage를 강화하는 방향으로 assay를 설계할 수 있습니다.

하지만 구조가 복잡해질수록 secondary structure가 target hybridization을 방해할 가능성도 생깁니다.

따라서 더 복잡한 probe가 항상 더 높은 성능을 의미하지는 않습니다.

Nanomaterial과 DSN을 결합하는 이유

DSN 기반 miRNA sensor 연구에서는 gold nanoparticle, graphene 계열 소재, magnetic particle 등과 결합한 다양한 구조도 사용됩니다.

이러한 nanomaterial은 probe immobilization, fluorescence quenching, target separation 또는 electrochemical signal generation 등에 활용될 수 있습니다.

예를 들어 surface에 DNA probe를 고정하고 target-dependent DSN cleavage가 일어나면 surface에 남아 있는 reporter의 양이 변하도록 설계할 수 있습니다.

이 변화를 fluorescence나 electrochemical signal로 측정할 수 있습니다.

이 경우에도 핵심적인 amplification mechanism은 동일합니다.

Target Hybridization

→ DSN Cleavage

→ Target Release

→ 다음 Probe Recognition

입니다.

Nanomaterial은 이 reaction을 측정 가능한 signal로 바꾸는 platform 역할을 합니다.

Electrochemical Detection과도 연결할 수 있다

DSN reaction은 fluorescence에만 제한되지 않습니다.

Electrode surface에 DNA probe를 고정하고 redox reporter를 연결할 수도 있습니다.

Target miRNA가 probe와 hybridization하면 DSN cleavage가 일어나고 reporter가 포함된 DNA fragment가 electrode에서 떨어져 나가도록 설계할 수 있습니다.

그러면 electrode surface의 redox reporter 양이 감소하면서 electrochemical signal이 변합니다.

즉, 동일한 DSN reaction이라도

Fluorescence

Electrochemical Signal

Colorimetric Signal

등 다양한 readout system과 연결할 수 있습니다.

따라서 DSN은 signal detector 자체라기보다 target-dependent probe cleavage를 반복시키는 amplification element입니다.

Target Recycling 속도가 무한히 증가하는 것은 아니다

이론적으로 하나의 miRNA가 계속 재사용될 수 있지만 실제 reaction에서는 무한히 반복되지 않습니다.

Target이 새로운 probe를 만나는 속도, hybridization rate, DSN cleavage rate, product dissociation과 enzyme activity 등이 전체 turnover를 제한합니다.

Reaction 시간이 지나면서 intact probe가 감소할 수도 있습니다.

또한 enzyme activity가 유지되는 시간도 고려해야 합니다.

따라서 DSN assay에서 amplification 정도는 단순히 target recycling이라는 개념만으로 결정되지 않고 전체 reaction kinetics에 의해 제한됩니다.

Background Cleavage도 고려해야 한다

민감한 biosensor에서는 target이 없는 상태의 background가 중요합니다.

DSN이 probe의 예상하지 않은 secondary structure나 probe끼리 형성한 duplex를 substrate로 인식하면 target-independent cleavage가 발생할 가능성이 있습니다.

또한 biological sample에 존재하는 다른 nucleic acid가 probe와 부분적으로 hybridization할 수도 있습니다.

이러한 반응이 reporter cleavage로 이어지면 false signal이 증가합니다.

따라서 probe끼리의 complementarity와 secondary structure를 줄이고 target sequence에 대한 선택성을 확보하는 것이 중요합니다.

실제 생체시료에서는 RNase 문제도 있다

miRNA는 RNA이기 때문에 RNase에 의해 분해될 수 있습니다.

정제된 synthetic miRNA를 사용하는 실험과 serum, plasma, cell lysate 같은 biological sample을 분석하는 조건은 다릅니다.

Sample preparation 과정에서 target RNA가 손실되거나 degradation될 수 있습니다.

또한 protein과 다른 nucleic acid가 hybridization 및 DSN activity에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 proof-of-concept 단계에서 낮은 detection limit이 보고되더라도 실제 clinical sample에서 동일한 분석 성능을 보인다고 바로 해석해서는 안 됩니다.

Sample preparation과 matrix effect를 별도로 검증해야 합니다.

CHA와 Target Recycling 방식이 어떻게 다를까?

앞서 살펴본 CHA 역시 target recycling을 이용합니다.

그러나 target을 재사용하는 방법은 다릅니다.

CHA에서는 target이 H1을 열고 H2와의 strand displacement를 유도한 뒤 방출됩니다.

즉, DNA hybridization과 structural rearrangement를 이용합니다.

DSN assay에서는 target이 DNA probe와 hybridization한 뒤 nuclease가 probe를 절단하기 때문에 target이 방출됩니다.

따라서

CHA → Strand Displacement 기반 Target Recycling

DSN → Enzymatic Cleavage 기반 Target Recycling

으로 구분할 수 있습니다.

최종적으로 여러 signal event를 만든다는 목적은 비슷하지만 이를 구현하는 molecular mechanism은 서로 다릅니다.

DSN과 HCR을 결합하는 Cascade도 가능하다

DSN reaction에서 생성된 fragment를 다른 nucleic acid circuit의 trigger로 사용할 수도 있습니다.

예를 들어 target-dependent DSN cleavage로 특정 DNA fragment가 방출되도록 설계하고 이 fragment가 HCR이나 CHA의 initiator 역할을 하게 만들 수 있습니다.

그러면

Target miRNA

→ DSN Recycling

→ 다수의 Trigger 생성

→ HCR 또는 CHA

→ 추가 Signal Amplification

과 같은 cascade system을 구성할 수 있습니다.

이론적으로 sensitivity를 크게 높일 수 있지만 amplification stage가 늘어날수록 background 역시 증폭될 가능성이 있습니다.

따라서 cascade assay에서는 단순한 최종 signal 크기보다 signal-to-background ratio가 중요합니다.

DSN 기반 miRNA 검출 과정을 정리하면

가장 기본적인 fluorescence assay를 기준으로 전체 과정을 정리하면 다음과 같습니다.

Target이 없는 경우

Single-Stranded DNA Probe

→ DSN Cleavage 제한

→ Fluorophore-Quencher 상태 유지

→ Low Fluorescence

Target miRNA가 존재하는 경우

Target miRNA

→ Complementary DNA Probe와 Hybridization

→ DNA-RNA Hybrid 형성

→ DSN Recognition

→ DNA Probe Cleavage

→ Reporter Signal 발생

→ Target miRNA 방출

→ 새로운 DNA Probe와 Hybridization

→ Cleavage Cycle 반복

결과적으로 하나의 target miRNA가 여러 reporter probe의 cleavage를 유도할 수 있습니다.

분자진단 연구에서 DSN이 갖는 의미

DSN 기반 detection의 핵심은 target을 직접 증폭하지 않는다는 데 있습니다.

Target miRNA의 양은 처음과 크게 달라지지 않지만 하나의 target이 반복적으로 여러 probe를 signal-producing state로 전환할 수 있습니다.

즉,

Target Copy Number Amplification

대신

Target-Dependent Reporter Turnover

를 이용합니다.

이러한 방식은 짧은 miRNA처럼 직접적인 nucleic acid amplification 설계가 까다로운 target에서 특히 흥미로운 전략이 될 수 있습니다.

또한 probe sequence를 변경하면 서로 다른 miRNA를 인식하도록 설계할 수 있고 fluorescence, electrochemical sensor 및 nanomaterial 기반 detection과도 연결할 수 있습니다.

마치며

Duplex-Specific Nuclease를 이용한 miRNA 검출은 DNA-RNA hybrid 형성과 선택적인 probe cleavage를 signal amplification으로 연결하는 기술입니다.

Target miRNA가 complementary DNA probe와 결합하면 DNA-RNA hybrid가 형성됩니다.

DSN은 이 구조에서 DNA probe를 절단하고, 짧아진 DNA fragment가 떨어지면서 miRNA가 다시 방출될 수 있습니다.

방출된 miRNA는 새로운 probe를 만나 동일한 reaction을 반복합니다.

따라서 전체 원리는

miRNA Recognition

→ DNA-RNA Hybrid Formation

→ DSN-Mediated DNA Cleavage

→ Target Release

→ Target Recycling

→ Repeated Reporter Cleavage

로 정리할 수 있습니다.

이 기술의 특징은 새로운 target nucleic acid를 합성하지 않으면서도 하나의 miRNA를 여러 번 재사용해 signal을 확대한다는 것입니다.

하지만 실제 성능은 DSN 자체의 activity만으로 결정되지 않습니다. Probe-target hybrid의 안정성, mismatch discrimination, cleavage 이후 target dissociation, background cleavage와 biological sample의 matrix effect가 함께 영향을 줍니다.

따라서 DSN 기반 miRNA biosensor의 핵심은 단순히 강한 nuclease activity를 확보하는 것이 아니라 표적은 보존하면서 reporter probe만 반복적으로 절단되는 reaction cycle을 얼마나 선택적으로 구현하는가에 있습니다.

※ 본 글은 Duplex-Specific Nuclease를 이용한 miRNA 신호 증폭 원리를 설명하기 위한 교육 목적의 콘텐츠이며 특정 miRNA를 확립된 질환 진단 바이오마커로 판단하거나 특정 질환에 대한 임상 진단 성능을 의미하지 않습니다.