Argonaute 단백질을 활용한 차세대 핵산 진단 기술의 원리

CRISPR가 guide RNA로 표적 핵산을 찾는다면 Argonaute 단백질도 짧은 guide nucleic acid를 이용해 상보적인 표적을 인식할 수 있습니다. 특히 일부 prokaryotic Argonaute는 guide-directed nucleic acid cleavage를 이용한 programmable 분자진단 도구로 연구되고 있습니다.

Argonaute는 어떤 단백질일까?

Argonaute는 다양한 생물에서 발견되는 nucleic acid-binding protein family입니다.

사람을 포함한 진핵생물에서는 Argonaute가 RNA interference와 gene silencing 과정에 중요한 역할을 합니다.

대표적으로 small RNA가 Argonaute에 결합하면 small RNA의 sequence information을 이용해 상보적인 RNA를 인식할 수 있습니다.

하지만 분자진단 기술에서 특히 관심을 받는 것은 prokaryotic Argonaute(pAgo)입니다.

세균과 고세균에서 발견되는 여러 Argonaute protein은 짧은 guide DNA 또는 guide RNA를 이용해 상보적인 nucleic acid target을 인식할 수 있습니다.

일부 pAgo에는 target strand를 절단할 수 있는 catalytic activity도 존재합니다.

이러한 특성을 이용하면 원하는 sequence를 인식하도록 guide를 설계하고 특정 DNA나 RNA를 선택적으로 절단하는 programmable nucleic acid system을 만들 수 있습니다.

Guide가 Target Sequence를 결정한다

Argonaute 기반 nucleic acid recognition에서 중요한 구성 요소 가운데 하나가 guide입니다.

Guide는 비교적 짧은 nucleic acid strand이며 Argonaute protein과 complex를 형성합니다.

Guide의 sequence는 검출하려는 target과 상보적으로 설계할 수 있습니다.

Argonaute-guide complex가 target nucleic acid를 만나면 guide와 target 사이에 base pairing이 형성됩니다.

따라서 어떤 target을 인식할 것인지는 상당 부분 guide sequence에 의해 결정됩니다.

전체 개념은

Argonaute Protein

Guide Nucleic Acid

→ Ago-Guide Complex

→ Complementary Target Recognition

으로 정리할 수 있습니다.

이러한 programmable recognition이 Argonaute를 molecular diagnostic tool로 활용하려는 중요한 이유입니다.

Argonaute의 구조는 Guide를 어떻게 이용할까?

대표적인 Argonaute protein은 여러 functional domain으로 구성됩니다.

주요 domain으로는

N domain

PAZ domain

MID domain

PIWI domain

등이 알려져 있습니다.

MID domain은 guide의 5′ 말단을 고정하는 데 중요한 역할을 할 수 있고 PAZ domain은 guide의 3′ 말단과 상호작용할 수 있습니다.

Guide가 Argonaute에 결합하면 target을 인식할 수 있는 형태로 배치됩니다.

PIWI domain은 일부 Argonaute에서 nuclease catalytic activity와 관련됩니다.

따라서 Argonaute는 단순히 guide를 붙잡는 단백질이 아니라 guide를 일정한 방향으로 배치하고 target recognition과 cleavage를 연결하는 molecular scaffold 역할을 합니다.

Seed Region은 Target Recognition에서 중요하다

Argonaute에 결합한 guide의 모든 nucleotide가 동일한 방식으로 target recognition에 기여하는 것은 아닙니다.

Guide의 5′ 쪽 일부 영역은 target recognition을 시작하는 데 중요한 seed region으로 작용할 수 있습니다.

Target이 접근하면 먼저 seed 영역과 상보적인 base pairing이 형성되고 이후 더 넓은 영역으로 guide-target duplex가 확장될 수 있습니다.

따라서 guide와 target 사이의 mismatch 위치에 따라 Argonaute activity에 미치는 영향도 달라질 수 있습니다.

이 특성은 특정 sequence를 선택적으로 구별하는 assay를 설계할 때 중요한 요소가 됩니다.

Target과 결합한 뒤 Cleavage가 일어날 수 있다

Catalytically active Argonaute에서는 guide와 충분히 상보적인 target이 결합하면 PIWI domain의 catalytic center가 target phosphodiester backbone을 절단할 수 있습니다.

이를 guide-directed cleavage라고 볼 수 있습니다.

즉,

Guide Loading

→ Target Recognition

→ Guide-Target Base Pairing

→ Catalytic Cleavage

라는 단계로 반응이 진행될 수 있습니다.

여기서 중요한 점은 모든 Argonaute protein이 동일한 substrate와 temperature에서 동일하게 작동하지 않는다는 것입니다.

Argonaute ortholog에 따라 guide preference, target type, reaction temperature 및 catalytic property가 달라질 수 있습니다.

따라서 ‘Argonaute는 DNA를 자른다’ 또는 ‘RNA를 자른다’고 하나의 특성으로 일반화해서는 안 됩니다.

DNA Guide를 사용하는 pAgo도 있다

분자진단 연구에서 주목받는 일부 prokaryotic Argonaute는 short DNA guide를 사용할 수 있습니다.

Guide DNA가 Argonaute에 loading되면 guide sequence와 상보적인 target을 찾아갈 수 있습니다.

이 특성은 assay 설계 측면에서 흥미롭습니다.

검출하고 싶은 target sequence가 바뀌었을 때 protein 자체를 새로 설계하는 대신 guide sequence를 변경해 target specificity를 조절할 수 있기 때문입니다.

즉,

Protein = 공통 Recognition/Cleavage Platform

Guide = Target Address

와 같은 구조로 생각할 수 있습니다.

이것이 programmable nuclease의 중요한 특징입니다.

Argonaute를 분자진단에 어떻게 이용할까?

Target cleavage 자체만으로는 사람이 바로 결과를 확인하기 어렵습니다.

따라서 Argonaute reaction을 fluorescence 같은 measurable signal과 연결해야 합니다.

한 가지 접근은 target-dependent cleavage가 reporter system을 활성화하도록 설계하는 것입니다.

예를 들어 Argonaute가 특정 nucleic acid product를 절단했을 때 새로운 strand가 생성되거나 reporter를 활성화할 수 있는 sequence가 노출되도록 만들 수 있습니다.

또는 upstream amplification에서 생성된 nucleic acid를 Argonaute가 인식하고 cleavage product를 downstream signal reaction과 연결할 수 있습니다.

따라서 Argonaute 기반 detection은 보통

Target Recognition

→ Ago-Mediated Cleavage

→ Signal Conversion

이라는 구조를 가집니다.

PCR과 결합하는 이유

Clinical sample에서 target nucleic acid가 극미량 존재한다면 Argonaute cleavage만으로 충분한 signal을 확보하기 어려울 수 있습니다.

이때 PCR 같은 amplification technology를 먼저 사용할 수 있습니다.

예를 들어 특정 target 영역을 PCR로 증폭합니다.

증폭된 product를 Argonaute-guide complex가 인식하도록 설계합니다.

그러면

Low-Concentration Target

→ PCR Amplification

→ Argonaute Recognition

→ Sequence-Specific Cleavage

→ Signal Detection

과 같은 assay가 가능합니다.

이 구조에서 PCR은 sensitivity를 높이는 역할을 하고 Argonaute는 sequence specificity를 추가하는 역할을 담당합니다.

등온 증폭과도 연결할 수 있다

Argonaute detection을 반드시 PCR과 연결해야 하는 것은 아닙니다.

RPA나 다른 isothermal amplification에서 생성된 product를 Argonaute가 인식하도록 설계할 수도 있습니다.

이 경우 thermal cycling 없이 amplification과 sequence-specific recognition을 연결하는 system을 연구할 수 있습니다.

다만 두 reaction을 결합할 때는 각각의 최적 조건을 고려해야 합니다.

Argonaute ortholog에 따라 높은 reaction temperature를 필요로 하는 경우가 있으며, 이러한 조건이 upstream amplification enzyme과 호환되지 않을 수 있습니다.

따라서 두 기술을 단순히 한 tube에 넣는 것만으로 one-pot reaction이 완성되는 것은 아닙니다.

Thermophilic Argonaute가 초기 연구에서 많이 사용된 이유

일부 잘 알려진 pAgo는 thermophilic microorganism에서 유래합니다.

이러한 Argonaute는 비교적 높은 온도에서 효율적인 catalytic activity를 나타낼 수 있습니다.

높은 온도는 double-stranded DNA의 strand separation과 target accessibility 측면에서 유리하게 작용할 수도 있습니다.

하지만 diagnostic platform에서는 단점도 됩니다.

현장형 진단에서 높은 온도를 유지하려면 heating system이 필요하기 때문입니다.

또한 다른 amplification enzyme과 결합하려면 서로 다른 최적 온도가 문제가 될 수 있습니다.

이 때문에 최근에는 보다 낮은 온도에서 작동할 수 있는 Argonaute system 역시 분자진단 연구에서 중요한 관심 대상입니다.

Double-Stranded DNA는 접근성 문제가 있다

Guide가 target과 base pairing하려면 target sequence가 접근 가능한 상태여야 합니다.

Single-stranded target에서는 guide가 비교적 직접적으로 접근할 수 있습니다.

하지만 dsDNA에서는 두 complementary strand가 이미 안정적인 duplex를 형성하고 있습니다.

따라서 guide가 내부 sequence에 바로 결합하기 어렵습니다.

높은 온도에서 DNA duplex가 부분적으로 분리되거나 별도의 strand separation 과정이 존재하면 target accessibility가 높아질 수 있습니다.

이 문제는 pAgo를 dsDNA detection에 활용할 때 고려해야 하는 중요한 조건입니다.

Single Nucleotide Variation도 구별할 수 있을까?

Argonaute의 guide-target recognition은 base pairing에 의존하기 때문에 mismatch에 영향을 받을 수 있습니다.

Guide와 target이 완전히 상보적인 경우에는 효율적인 recognition과 cleavage가 일어날 수 있습니다.

반면 특정 위치에 mismatch가 존재하면 cleavage efficiency가 감소할 수 있습니다.

이를 이용하면 wild-type과 mutant sequence 사이의 single nucleotide difference를 구별하는 assay를 설계할 가능성이 있습니다.

하지만 모든 mismatch가 동일한 효과를 나타내는 것은 아닙니다.

Mismatch의 위치와 종류, 사용하는 Argonaute ortholog 및 reaction condition에 따라 discrimination 정도가 달라질 수 있습니다.

따라서 Argonaute 기반 SNP detection에서는 guide design과 mismatch position을 실험적으로 검증해야 합니다.

CRISPR-Cas와 무엇이 비슷할까?

Argonaute와 CRISPR-Cas system은 모두 guide nucleic acid를 이용해 원하는 target을 programmable하게 인식할 수 있다는 공통점이 있습니다.

Cas12에서는 crRNA가 target DNA recognition을 안내합니다.

Cas13에서는 guide RNA가 target RNA를 인식하도록 합니다.

Argonaute 역시 guide nucleic acid의 sequence information을 이용해 complementary target을 찾을 수 있습니다.

따라서 두 system 모두

Protein + Guide

→ Sequence-Specific Target Recognition

이라는 기본적인 구조를 가지고 있습니다.

하지만 세부적인 protein architecture와 catalytic mechanism은 서로 다릅니다.

CRISPR와 Argonaute는 동일한 시스템이 아니다

공통점 때문에 Argonaute를 ‘CRISPR의 다른 종류’처럼 이해해서는 안 됩니다.

두 protein family는 서로 다른 biological system입니다.

CRISPR-Cas는 prokaryotic adaptive immune system과 관련된 machinery입니다.

반면 Argonaute는 별도의 protein family이며 진핵생물에서는 RNA interference에 핵심적인 역할을 합니다.

Prokaryotic Argonaute의 biological function도 CRISPR-Cas와 동일한 adaptive immune mechanism으로 단순화할 수 없습니다.

따라서 분자진단에서 두 기술을 비교할 때는 ‘guide-directed programmable nucleic acid recognition’이라는 기능적 공통점과 생물학적 차이를 구분해야 합니다.

PAM Requirement에서도 차이가 나타날 수 있다

Cas12a와 같은 CRISPR nuclease는 dsDNA target recognition에서 적절한 PAM sequence를 요구합니다.

따라서 원하는 mutation 주변에 적합한 PAM이 존재하는지가 assay design에 영향을 줄 수 있습니다.

여러 pAgo system에서는 CRISPR-Cas와 동일한 PAM requirement를 사용하지 않습니다.

이 때문에 target sequence 선택 측면에서 다른 설계 가능성을 제공할 수 있습니다.

하지만 이를 ‘Argonaute에는 sequence constraint가 전혀 없다’고 해석해서는 안 됩니다.

Guide length, guide end chemistry, target structure와 Argonaute 종류 등에 따라 별도의 substrate requirement와 sequence preference가 존재할 수 있습니다.

Collateral Cleavage에서도 차이가 있다

Cas12와 Cas13 기반 diagnostic system에서 중요한 특징 가운데 하나는 target recognition 후 나타나는 collateral cleavage입니다.

Cas12는 적절한 target에 의해 활성화된 후 주변 ssDNA reporter를 trans-cleavage할 수 있습니다.

Cas13은 target RNA recognition 후 ssRNA reporter cleavage를 이용할 수 있습니다.

이러한 collateral activity 자체가 강력한 signal amplification mechanism으로 사용됩니다.

Argonaute 기반 system에서는 모든 pAgo가 Cas12 또는 Cas13과 동일한 방식의 nonspecific collateral cleavage를 나타낸다고 볼 수 없습니다.

따라서 Argonaute diagnostic assay에서는 target cleavage product를 다른 reaction으로 연결하거나 별도의 signal amplification architecture를 구성하는 방식이 중요할 수 있습니다.

PfAgo 기반 Multiplex Detection 연구

Argonaute 기반 진단에서 많이 연구된 예 가운데 하나가 Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)입니다.

PfAgo는 thermophilic Argonaute로 DNA-guided DNA cleavage를 수행할 수 있습니다.

이러한 특성을 이용해 특정 nucleic acid sequence를 인식하고 여러 target을 구분하는 assay들이 연구되었습니다.

특히 PCR amplification과 PfAgo cleavage를 연결한 nucleic acid detection platform에서는 서로 다른 guide를 이용해 여러 target을 구별하는 전략이 가능합니다.

Guide sequence를 바꾸는 방식으로 target identity를 프로그래밍할 수 있기 때문입니다.

다만 PfAgo는 높은 온도에서 작동하는 특성이 있으므로 실제 point-of-care platform으로 전환할 때는 temperature control을 고려해야 합니다.

PAND라는 Argonaute 기반 검출 전략

Argonaute를 활용한 nucleic acid detection 연구에서는 PAND(PfAgo-mediated Nucleic Acid Detection)와 같은 전략도 제시되었습니다.

기본 개념은 PfAgo의 programmable DNA cleavage를 signal generation과 연결하는 것입니다.

Target-derived sequence가 적절한 guide와 함께 PfAgo reaction에 참여하면 sequence-specific cleavage가 발생합니다.

이 cleavage event를 fluorescent reporter activation으로 연결해 target 존재 여부를 판별할 수 있습니다.

이러한 연구가 보여주는 핵심은 Argonaute가 단순히 genome biology에서 연구되는 protein을 넘어 programmable nucleic acid detection component로 활용될 수 있다는 점입니다.

Ago의 Cleavage Product를 새로운 Guide로 활용할 수도 있다

Argonaute system의 흥미로운 연구 방향 가운데 하나는 cleavage reaction을 cascade로 연결하는 것입니다.

첫 번째 Argonaute reaction에서 생성된 nucleic acid fragment가 다음 Argonaute reaction의 guide 또는 trigger 역할을 하도록 system을 설계할 수 있습니다.

그러면 하나의 target recognition event를 여러 cleavage reaction으로 연결할 가능성이 생깁니다.

개념적으로는

Target Recognition

→ First Cleavage

→ 새로운 Guide 또는 Trigger 생성

→ Second Cleavage

→ Signal Amplification

과 같은 구조입니다.

이러한 방식은 Argonaute에 Cas12와 같은 전형적인 collateral cleavage mechanism이 없더라도 cascade reaction을 통해 signal을 증폭하려는 전략으로 이해할 수 있습니다.

Guide 설계가 중요한 이유

Argonaute assay의 성능은 단순히 protein 종류만으로 결정되지 않습니다.

Guide length와 sequence, 5′ end 상태, target과의 complementarity 등이 activity에 영향을 줄 수 있습니다.

Target에 secondary structure가 존재하면 guide가 접근하기 어려울 수도 있습니다.

또한 target과 유사한 sequence가 sample에 많이 존재한다면 off-target cleavage 가능성도 고려해야 합니다.

따라서 Argonaute 기반 assay에서는

Guide Selection

Target Accessibility

Mismatch Position

Reaction Temperature

Reporter Architecture

를 함께 최적화해야 합니다.

Multiplex Detection에 적합한 이유

여러 target을 동시에 분석하려면 target별 recognition element가 필요합니다.

Argonaute에서는 서로 다른 guide를 준비함으로써 여러 sequence를 인식하도록 설계할 수 있습니다.

예를 들어 target A에는 guide A, target B에는 guide B, target C에는 guide C를 사용할 수 있습니다.

각 target recognition을 서로 다른 reporter signal과 연결하면 multiplex detection system을 구성할 수 있습니다.

하지만 실제 multiplex reaction에서는 여러 guide 사이의 cross-reaction과 reporter signal overlap, target concentration 차이 등을 고려해야 합니다.

따라서 programmable하다는 특징이 자동으로 높은 multiplex performance를 보장하는 것은 아닙니다.

Argonaute 기반 진단의 한계

Argonaute는 흥미로운 programmable nuclease이지만 CRISPR 진단을 바로 대체한다고 단정할 단계는 아닙니다.

사용하는 pAgo마다 biochemical property가 상당히 다를 수 있습니다.

일부는 높은 온도가 필요하고 일부는 특정 guide structure를 선호할 수 있습니다.

dsDNA target의 경우 target accessibility 문제도 존재합니다.

또한 clinical sample에서는 amplification, sample preparation 및 reporter detection까지 하나의 platform으로 통합해야 합니다.

무엇보다 연구 논문에서 높은 sensitivity가 보고된 것과 실제 임상검사로 검증되고 표준화된 것은 별개의 문제입니다.

따라서 Argonaute 기반 nucleic acid detection은 현재의 연구 성과와 임상적 활용 수준을 구분해서 설명해야 합니다.

Argonaute 기반 검출 과정을 정리하면

가장 기본적인 guide-directed cleavage assay를 기준으로 하면 다음과 같습니다.

Target이 없는 경우

Argonaute + Guide

→ Ago-Guide Complex

→ Complementary Target 없음

→ Target-Dependent Cleavage 없음

→ Low Signal

Target이 존재하는 경우

Guide Loading

→ Complementary Target Recognition

→ Guide-Target Base Pairing

→ Argonaute Catalytic Cleavage

→ Cleavage Product 생성

→ Reporter System 활성화

→ Signal Detection

Amplification을 추가한다면 앞 단계에 PCR 또는 isothermal amplification을 배치하거나 cleavage product를 downstream reaction의 trigger로 활용할 수 있습니다.

Argonaute가 분자진단에서 갖는 의미

Argonaute 기반 detection에서 가장 중요한 특징은 guide sequence를 이용해 protein의 target recognition을 프로그래밍할 수 있다는 것입니다.

새로운 target을 검출할 때마다 완전히 새로운 enzyme을 만드는 것이 아니라 적절한 guide를 설계해 target specificity를 변경할 수 있습니다.

이는 CRISPR-Cas가 분자진단에서 주목받은 이유와 기능적으로 유사한 부분입니다.

하지만 Argonaute는 CRISPR와 다른 protein family이며 guide preference, target substrate, cleavage mechanism과 reaction condition도 다릅니다.

따라서 Argonaute의 가치는 단순히 ‘CRISPR를 대신하는 기술’이라고 설명하기보다 guide-directed nucleic acid cleavage라는 또 하나의 programmable molecular recognition platform을 제공한다는 점에서 찾는 것이 적절합니다.

마치며

Argonaute는 짧은 guide nucleic acid를 이용해 complementary target을 인식할 수 있는 protein family입니다.

특히 일부 prokaryotic Argonaute는 guide-directed nuclease activity를 가지고 있어 nucleic acid detection platform으로 연구되고 있습니다.

기본적인 원리는

Guide Loading

→ Target Recognition

→ Guide-Target Hybridization

→ Argonaute-Mediated Cleavage

→ Signal Conversion

으로 정리할 수 있습니다.

PCR이나 isothermal amplification과 결합하면 낮은 농도의 target을 먼저 증폭한 뒤 Argonaute를 이용해 sequence specificity를 추가할 수도 있습니다.

또한 guide sequence를 변경해 새로운 target에 대응할 수 있기 때문에 mutation discrimination과 multiplex nucleic acid detection에도 응용 가능성이 연구되고 있습니다.

그러나 Argonaute마다 작동 온도와 guide preference, target substrate가 다르며 dsDNA accessibility와 signal amplification 방법도 해결해야 할 문제입니다.

결국 Argonaute 기반 분자진단의 핵심은 단순한 nuclease activity가 아니라 짧은 guide에 저장된 sequence 정보를 이용해 원하는 nucleic acid를 선택하고 그 recognition event를 cleavage와 측정 가능한 signal로 연결하는 programmable detection architecture에 있습니다.

※ 본 글은 Argonaute 기반 핵산 검출 기술의 원리를 설명하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다. 연구 단계의 Argonaute assay 성능을 확립된 임상 진단법의 성능으로 해석해서는 안 됩니다.