seqFISH+ 원리: 반복 형광 영상으로 1만 개 유전자의 공간적 발현을 분석하는 방법

조직에서 수천 종류의 RNA를 동시에 관찰하려면 형광 신호가 서로 겹치는 문제를 해결해야 합니다. seqFISH+는 반복적인 핵산 혼성화와 가상 색상 바코드를 이용해 많은 RNA를 구별하는 기술입니다. 조직의 형태를 유지하면서 유전자 발현과 세포 내 위치를 분석하는 원리를 살펴봅니다.

1. 공간 전사체 분석에서 형광 신호가 겹치는 이유

RNA는 세포 안에서 균일하게 분포하지 않습니다.

일부 RNA는 세포핵 주변에 집중되고, 다른 RNA는 세포질이나 세포 돌기에서 관찰될 수 있습니다.

이러한 위치 차이는 RNA의 이동과 번역, 세포 기능을 이해하는 데 중요한 정보입니다.

일반적인 RNA-seq은 많은 유전자의 발현량을 분석할 수 있지만, RNA가 조직의 어느 위치에 존재했는지는 직접 보여주지 못합니다.

반면 형광 제자리 혼성화(FISH)는 RNA를 세포 안에서 관찰할 수 있습니다.

문제는 동시에 분석하는 RNA 종류가 증가할수록 형광 신호도 많아진다는 점입니다.

서로 가까이 있는 RNA에서 같은 색의 형광 신호가 발생하면 현미경에서 하나의 점처럼 보일 수 있습니다.

이러한 현상을 광학적 신호 중첩 또는 Optical Crowding이라고 합니다.

seqFISH+는 RNA를 여러 영상으로 나누어 관찰하는 방식으로 이 문제를 줄입니다.

2. seqFISH+는 어떤 기술일까?

seqFISH+는 Sequential Fluorescence In Situ Hybridization을 발전시킨 공간 전사체 분석 기술입니다.

기본 원리는 RNA에 결합한 probe를 여러 차례 형광으로 읽어 유전자별 바코드를 만드는 것입니다.

일반적인 FISH에서는 특정 RNA에 하나의 형광 색상을 부여할 수 있습니다.

그러나 seqFISH+에서는 여러 번의 혼성화와 영상 촬영을 통해 하나의 RNA에 여러 자리의 바코드를 부여합니다.

따라서 제한된 형광 채널로도 많은 유전자를 구별할 수 있습니다.

2019년 Eng와 연구진은 Nature에 발표한 연구에서 seqFISH+를 이용해 생쥐 뇌 조직의 1만 개 유전자를 분석했습니다.

이 연구는 조직 내 세포 종류와 RNA의 세포 내 위치를 함께 분석할 수 있음을 보여줬습니다. <Cite ref=”turn296929search0″/>

3. Pseudocolor는 실제 형광 색상과 어떻게 다를까?

seqFISH+의 핵심 개념은 Pseudocolor, 즉 가상 색상입니다.

일반적인 형광 영상에서는 서로 다른 형광물질을 이용해 신호를 구분합니다.

예를 들어 녹색과 적색, 원적색 형광을 사용하면 세 가지 채널을 구별할 수 있습니다.

하지만 같은 채널에서 형광 신호를 제거하고 새로운 probe를 결합한 뒤 다시 촬영하면 이전 영상과 새로운 영상을 별도로 기록할 수 있습니다.

이렇게 서로 다른 촬영 시점에 얻은 신호를 각각 다른 가상 색상으로 취급합니다.

예를 들어 하나의 형광 채널에서 20차례의 혼성화와 촬영을 수행하면 20개의 Pseudocolor를 만들 수 있습니다.

실제로 형광물질 20종류를 동시에 사용한다는 의미는 아닙니다.

동일한 형광 채널을 시간적으로 나누어 사용한다는 점이 중요합니다.

이러한 방식은 동시에 관찰되는 RNA 신호의 밀도를 낮추는 데 도움이 됩니다.

4. seqFISH+의 바코드는 어떻게 만들어질까?

seqFISH+에서는 유전자마다 고유한 바코드를 배정합니다.

바코드의 각 자리는 여러 Pseudocolor 가운데 하나로 구성됩니다.

예를 들어 한 채널에서 20개의 Pseudocolor를 사용할 수 있다고 가정하겠습니다.

첫 번째 바코드 자리에는 20개 가운데 하나의 값을 배정할 수 있습니다.

두 번째와 세 번째 자리에도 각각 20개 가운데 하나의 값을 배정할 수 있습니다.

따라서 세 자리만으로 표현할 수 있는 조합은 다음과 같습니다.

20 × 20 × 20 = 8,000

즉, 하나의 형광 채널에서 이론적으로 8,000개의 서로 다른 유전자 바코드를 만들 수 있습니다.

세 개의 형광 채널을 독립적으로 사용하면 전체 바코드 수용량은 다음과 같습니다.

3 × 8,000 = 24,000

이는 2019년 원천 연구에서 제시한 바코드 설계의 기본 원리입니다.

다만 24,000개는 해당 설계의 바코드 수용량이며, 원천 연구에서 실제로 24,000개 유전자를 모두 측정했다는 의미는 아닙니다.

해당 연구에서 실제로 분석한 유전자 수는 10,000개입니다. <Cite ref=”turn296929search2″/>

5. 오류 교정을 위한 추가 바코드가 필요한 이유

반복적인 형광 영상에서는 일부 신호가 누락되거나 잘못 검출될 수 있습니다.

예를 들어 특정 RNA가 두 번째 바코드 자리에서 Pseudocolor 7을 나타내도록 설계됐다고 가정하겠습니다.

하지만 probe 결합이 충분하지 않거나 영상 품질이 낮으면 해당 신호를 검출하지 못할 수 있습니다.

이러한 오류가 발생하면 RNA를 다른 유전자로 잘못 판독할 위험이 있습니다.

2019년 seqFISH+ 연구에서는 세 자리의 바코드 정보를 읽은 뒤 추가적인 오류 교정 자리를 사용했습니다.

따라서 단순히 세 번의 형광 촬영만으로 모든 유전자를 구별하는 것은 아닙니다.

원천 연구의 대표적인 설계에서는 각 형광 채널에서 20개의 Pseudocolor를 사용하고, 네 개의 바코드 자리를 판독했습니다.

앞의 세 자리는 유전자 식별에 사용하고, 추가 자리는 오류 교정에 활용했습니다.

이러한 설계는 일부 잘못된 신호가 발생하더라도 RNA 식별의 신뢰성을 높이는 데 도움이 됩니다.

6. seqFISH+ 실험은 어떤 순서로 진행될까?

대표적인 seqFISH+ 실험은 다음과 같은 단계로 구성됩니다.

① 세포 또는 조직을 준비하고 RNA가 원래 위치에 보존되도록 처리합니다.

② 표적 RNA에 결합하는 Primary Probe를 혼성화합니다.

③ 첫 번째 바코드 정보를 읽기 위한 형광 Readout Probe를 결합시킵니다.

④ 현미경으로 형광 영상을 촬영합니다.

⑤ 기존 형광 신호를 제거하고 다음 Readout Probe를 결합시킵니다.

⑥ 여러 차례의 혼성화와 영상 촬영을 반복합니다.

⑦ 서로 다른 영상에서 관찰된 RNA 점의 위치를 정렬합니다.

⑧ 각 RNA의 바코드를 판독하고 세포별 발현 정보를 구성합니다.

이 과정에서 중요한 것은 동일한 RNA 분자를 여러 촬영 회차에서 정확하게 추적하는 것입니다.

검체가 이동하거나 영상 정렬에 오류가 발생하면 서로 다른 RNA의 신호를 하나의 바코드로 잘못 조합할 수 있습니다.

따라서 반복 영상의 위치 정합과 형광 신호 제거가 중요한 품질관리 항목입니다.

7. seqFISH+가 광학적 신호 중첩을 줄이는 방법

seqFISH+는 모든 RNA를 하나의 영상에서 동시에 밝게 표시하지 않습니다.

대신 특정 촬영 회차에서 전체 RNA의 일부만 형광 신호를 나타내도록 설계합니다.

예를 들어 20개의 Pseudocolor를 사용하면 하나의 Pseudocolor 영상에서 관찰되는 RNA 신호의 밀도를 낮출 수 있습니다.

이렇게 하면 원래 하나의 형광 점처럼 겹쳐 보이던 RNA를 서로 다른 영상에서 구별할 가능성이 높아집니다.

원천 연구에서는 60개의 Pseudocolor를 사용해 RNA 신호를 여러 영상으로 분산했습니다.

이 60개는 세 개의 형광 채널에 각각 20개의 Pseudocolor를 배정한 결과입니다.

연구진은 이를 통해 일반적인 공초점 현미경에서도 서로 가까운 RNA의 위치를 구별할 수 있음을 제시했습니다.

다만 모든 RNA를 무조건 구별할 수 있다는 의미는 아닙니다.

동일한 Pseudocolor에서 RNA가 매우 밀집돼 있거나 영상 품질이 낮으면 신호가 겹칠 수 있습니다.

8. 2019년 원천 연구의 주요 결과

Eng와 연구진은 seqFISH+를 이용해 배양세포와 생쥐 뇌 조직을 분석했습니다.

연구에서는 10,000개 유전자를 대상으로 RNA의 종류와 위치를 판독했습니다.

주요 결과는 다음과 같습니다.

분석 항목	연구에서 보고한 결과
표적 유전자 수	10,000개
사용한 Pseudocolor	총 60개
형광 채널	3개
NIH3T3 세포의 평균 검출 RNA	약 35,492개
단일세포 RNA 검출 수의 표준편차	약 12,222개
smFISH 대비 검출 효율	약 49%

연구진은 NIH3T3 세포에서 RNA의 세포 내 위치를 분석했습니다.

또한 생쥐의 대뇌피질과 뇌실하영역, 후각망울에서 서로 다른 세포 집단의 공간적 분포를 조사했습니다.

이러한 결과는 seqFISH+가 유전자 발현량뿐 아니라 조직 내 세포의 위치와 세포 내부 RNA 분포를 함께 분석할 수 있음을 보여줍니다.

다만 검출 효율 49%는 해당 연구에서 smFISH와 비교한 결과입니다.

모든 seqFISH+ 실험에서 동일한 검출 효율이 나타나는 것은 아닙니다. <Cite ref=”turn296929search1″/>

9. seqFISH+에서 Super-Resolution은 무엇을 의미할까?

seqFISH+ 연구에서는 Super-Resolved Imaging이라는 표현을 사용합니다.

이는 RNA 신호를 여러 영상으로 분리해 원래 하나의 영상에서 구별하기 어려웠던 가까운 RNA의 위치를 추정할 수 있다는 의미입니다.

특히 신호 밀도를 낮춘 개별 영상에서 RNA 점의 중심 위치를 계산한 뒤, 여러 영상을 다시 결합할 수 있습니다.

이러한 방식은 일반적인 광학 해상도 한계보다 가까운 RNA 신호를 구별하는 데 도움이 됩니다.

그러나 seqFISH+가 모든 현미경의 물리적 해상도 한계를 완전히 제거한다는 뜻은 아닙니다.

개별 RNA의 위치 추정 정확도는 형광 신호의 세기와 배경 신호, 광학 장비, 영상 분석 방법에 영향을 받습니다.

또한 서로 가까운 RNA가 같은 Pseudocolor에서 동시에 나타나면 여전히 신호 중첩이 발생할 수 있습니다.

따라서 Super-Resolution이라는 표현은 반복 영상과 위치 추정에 기반한 분석적 특성으로 이해해야 합니다.

10. MERFISH와 seqFISH+의 차이

MERFISH와 seqFISH+는 모두 반복적인 형광 영상을 이용해 많은 RNA를 구별합니다.

그러나 바코드 설계와 신호 밀도 문제를 해결하는 방법에 차이가 있습니다.

비교 항목	seqFISH+	MERFISH
기본 원리	반복 혼성화와 Pseudocolor 조합	반복 형광 영상과 오류에 강한 바코드
주요 바코드 방식	다중 Pseudocolor 조합	주로 이진 바코드
핵심 설계 목표	광학적 신호 중첩 감소	다중 검출과 바코드 오류 제어
공간 정보	RNA의 세포 내 위치 분석	RNA의 세포 내 위치 분석
대표 원천 연구	Eng et al., 2019	Chen et al., 2015
주요 제한	영상 정합과 신호 중첩	바코드 판독 오류와 검출 누락

두 기술 모두 미리 선택한 유전자에 맞춰 probe를 설계해야 합니다.

따라서 모든 RNA를 사전 정보 없이 자동으로 검출하는 기술은 아닙니다.

또한 검출 효율과 처리량은 표적 유전자 수, 장비, 영상 촬영 조건에 따라 달라집니다.

11. seqFISH+와 단일세포 RNA-seq을 함께 사용하는 이유

단일세포 RNA-seq(scRNA-seq)은 세포별 유전자 발현을 폭넓게 분석할 수 있습니다.

그러나 일반적인 scRNA-seq에서는 조직을 단일세포로 분리하기 때문에 원래의 공간적 위치 정보가 사라질 수 있습니다.

반면 seqFISH+는 조직 구조를 유지하면서 RNA의 위치를 분석합니다.

따라서 두 기술을 함께 활용하면 세포의 전사 특성과 조직 내 위치를 연결할 수 있습니다.

2019년 원천 연구에서도 seqFISH+로 분류한 세포 집단을 scRNA-seq 자료와 비교했습니다.

연구진은 두 방법에서 유사한 세포 종류별 발현 특성이 나타나는지 평가했습니다.

그러나 두 기술의 발현값이 반드시 동일하게 측정되는 것은 아닙니다.

RNA 추출과 증폭 여부, probe 결합 효율, 시퀀싱 깊이 등 분석 원리가 서로 다르기 때문입니다.

따라서 비교할 때는 기술별 측정 특성과 정규화 방법을 고려해야 합니다.

12. RNA가 세포핵 주변에 집중되면 무엇을 의미할까?

seqFISH+는 RNA의 세포 내 위치를 분석할 수 있습니다.

예를 들어 특정 RNA가 세포핵 주변에서 주로 관찰될 수 있습니다.

반면 다른 RNA는 세포질 전체에 넓게 분포하거나 세포 돌기에 집중될 수 있습니다.

이러한 차이는 RNA의 이동과 국소적인 번역 조절에 관한 연구에 도움이 됩니다.

2019년 연구에서는 NIH3T3 세포에서 RNA의 위치를 분석해 핵 주변과 세포질, 세포 돌기 등 서로 다른 분포 특성을 확인했습니다.

또한 생쥐 뇌 조직에서도 세포 종류에 따라 RNA의 위치 특성이 다르게 나타날 수 있음을 제시했습니다.

그러나 특정 RNA가 세포핵 주변에 집중됐다는 사실만으로 해당 RNA의 기능을 확정할 수는 없습니다.

RNA의 위치는 세포 형태와 세포주기, 분화 상태 등 여러 조건의 영향을 받을 수 있기 때문입니다.

13. 가상의 seqFISH+ 데이터 해석 사례

세 가지 세포 집단에서 특정 유전자들의 RNA를 분석했다고 가정하겠습니다.

유전자	세포 집단 A	세포 집단 B	세포 집단 C
Gene 1	42	8	5
Gene 2	6	35	9
Gene 3	4	12	39
Gene 4	18	17	16

표의 숫자는 세포당 평균 검출 RNA 수를 가정한 값입니다.

이 결과에서는 Gene 1이 세포 집단 A에서 상대적으로 많이 검출됩니다.

Gene 2는 세포 집단 B에서, Gene 3은 세포 집단 C에서 상대적으로 많이 검출됩니다.

반면 Gene 4는 세 집단에서 비슷한 수준으로 나타납니다.

이러한 패턴은 세포 집단을 구분하는 후보 표지를 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

그러나 하나의 유전자만으로 세포 종류를 확정해서는 안 됩니다.

또한 평균 검출 수의 차이가 실제 생물학적 차이인지 판단하려면 충분한 세포 수와 반복 실험이 필요합니다.

이 표는 분석 원리를 설명하기 위한 가상 사례입니다.

14. seqFISH+에서 위양성이 발생하는 원인

seqFISH+는 다중 바코드를 이용해 RNA를 구별하지만 위양성 가능성이 존재합니다.

Probe의 비특이적 결합

Primary Probe가 표적이 아닌 RNA에 결합하면 잘못된 형광 신호가 나타날 수 있습니다.

영상 정합 오류

서로 다른 촬영 회차의 영상이 정확하게 정렬되지 않으면 다른 RNA의 신호가 하나의 바코드로 조합될 수 있습니다.

형광 신호의 불완전한 제거

이전 촬영에서 사용한 형광 신호가 남아 있으면 다음 Pseudocolor 영상에 영향을 줄 수 있습니다.

광학적 신호 중첩

동일한 Pseudocolor에서 여러 RNA가 가까이 위치하면 신호가 하나로 합쳐질 수 있습니다.

따라서 seqFISH+에서는 probe 특이성과 영상 정합, 형광 신호 제거, 바코드 판독의 정확성을 함께 평가해야 합니다.

15. 검출되지 않은 RNA는 실제로 없는 것일까?

seqFISH+에서 특정 RNA가 검출되지 않았다고 해서 해당 RNA가 세포에 존재하지 않는다고 확정할 수는 없습니다.

RNA가 매우 낮은 수준으로 발현되면 검출되지 않을 수 있습니다.

또한 RNA가 손상됐거나 probe가 충분히 결합하지 못한 경우에도 신호가 감소할 수 있습니다.

영상 촬영 과정에서 형광 신호가 약하게 나타나거나 배경 신호에 묻힐 수도 있습니다.

특히 RNA가 밀집된 구간에서는 신호 중첩으로 인해 일부 분자를 구별하지 못할 수 있습니다.

따라서 음성 결과는 검출 한계와 검체 품질, probe 설계 조건을 함께 고려해야 합니다.

16. seqFISH+에서 세포 경계를 정확하게 구분해야 하는 이유

seqFISH+는 RNA의 위치를 확인할 수 있지만, 해당 RNA가 어느 세포에 속하는지 구분하는 과정이 필요합니다.

이를 Cell Segmentation이라고 합니다.

일반적으로 세포핵이나 세포 경계에 관한 영상 정보를 이용해 세포 영역을 구분합니다.

이후 각 RNA 신호를 해당 세포에 배정합니다.

그러나 세포가 밀집된 조직에서는 세포 경계가 불분명할 수 있습니다.

특히 신경세포처럼 긴 돌기를 가진 세포에서는 RNA가 세포체에서 멀리 떨어진 위치에 존재할 수 있습니다.

이 경우 RNA를 다른 세포에 잘못 배정할 가능성이 있습니다.

따라서 세포별 발현 분석에서는 바코드 판독뿐 아니라 세포 분할의 정확성도 중요합니다.

17. seqFISH+가 조직 내 세포 간 관계를 분석하는 방법

seqFISH+는 세포별 RNA 발현과 위치 정보를 함께 제공합니다.

따라서 서로 가까이 있는 세포들이 어떤 유전자 발현 특성을 가지는지 비교할 수 있습니다.

예를 들어 특정 수용체 RNA를 발현하는 세포와 해당 수용체의 리간드 RNA를 발현하는 세포가 인접해 있는지 분석할 수 있습니다.

2019년 원천 연구에서도 생쥐 뇌 조직에서 인접한 세포 사이의 리간드와 수용체 관련 발현 패턴을 조사했습니다.

이러한 분석은 세포 간 신호 전달 가능성을 탐색하는 데 도움이 됩니다.

그러나 리간드 RNA와 수용체 RNA가 가까운 세포에서 검출됐다는 사실만으로 실제 단백질 간 결합이나 신호 전달이 발생했다고 확정할 수는 없습니다.

RNA 발현과 단백질 발현은 반드시 일치하지 않기 때문입니다.

따라서 세포 간 상호작용을 확인하려면 단백질 분석이나 기능적 검증이 필요할 수 있습니다.

18. seqFISH+의 분자진단적 활용 가능성

seqFISH+는 조직 내 세포의 위치와 유전자 발현을 함께 분석할 수 있습니다.

따라서 종양 조직에서 암세포와 면역세포, 기질세포의 발현 특성을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

또한 특정 질환 조직에서 세포 집단의 구성과 위치 관계가 어떻게 달라지는지 평가할 수 있습니다.

이러한 정보는 질환 관련 바이오마커를 탐색하는 데 도움이 됩니다.

그러나 seqFISH+에서 특정 발현 패턴이 관찰됐다는 사실만으로 질환을 진단할 수는 없습니다.

임상 검사로 활용하려면 검체 처리와 probe 설계, 영상 분석, 바코드 판독 및 판정 기준에 대한 검증이 필요합니다.

따라서 seqFISH+는 현재 일반적인 확진 검사보다 공간 전사체 연구와 바이오마커 탐색에 활용되는 기술로 이해하는 것이 적절합니다.

19. seqFISH+의 분석적 가치와 한계

seqFISH+는 반복적인 형광 혼성화와 Pseudocolor 바코드를 이용해 많은 RNA를 동시에 구별하는 기술입니다.

2019년 원천 연구에서는 10,000개 유전자를 대상으로 생쥐 뇌 조직의 RNA 발현과 공간적 위치를 분석했습니다.

또한 여러 영상으로 RNA 신호를 분산해 광학적 신호 중첩을 줄이는 방법을 제시했습니다.

이러한 특징은 조직 내 세포 종류와 RNA의 세포 내 위치를 함께 연구하는 데 도움이 됩니다.

그러나 seqFISH+는 probe 설계와 영상 정합, 형광 신호 제거, 바코드 판독 및 세포 분할의 영향을 받습니다.

또한 검출된 RNA 수가 실제 RNA 분자 수와 정확히 일치한다고 가정해서는 안 됩니다.

따라서 결과를 해석할 때는 검출 효율과 오류율, 대조군 결과를 함께 확인해야 합니다.

seqFISH+의 핵심적인 가치는 반복 형광 영상을 이용해 RNA 신호의 밀도를 낮추면서 수많은 유전자의 발현 위치를 구별할 수 있다는 점입니다.

이는 유전자 발현량과 조직 내 세포 위치를 연결하는 데 중요한 정보를 제공하지만, 특정 RNA 발현 패턴만으로 질환의 원인을 확정하는 기술과는 구별해야 합니다.

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참고문헌

1. Eng CHL, Lawson M, Zhu Q, et al. (2019).

Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH+.

Nature, 568, 235–239.

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-019-1049-y

seqFISH+의 원리와 Pseudocolor 바코드 설계를 제시하고 생쥐 뇌 조직에서 10,000개 유전자를 분석한 원천 연구입니다.

2. Eng CHL, et al. (2019). 원천 연구 공개 전문.

PubMed Central: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6544023/

60개 Pseudocolor 설계와 오류 교정, RNA 검출 효율 및 세포 내 RNA 위치 분석 결과를 확인할 수 있습니다.

3. Asp M, Bergenstråhle J, Lundeberg J. (2020).

Spatially Resolved Transcriptomes—Next Generation Tools for Tissue Exploration.

BioEssays, 42(10), 1900221.

DOI: https://doi.org/10.1002/bies.201900221

seqFISH+를 포함한 공간 전사체 분석 기술의 원리와 장점, 제한 요소를 비교한 검토 문헌입니다.

4. Yan et al. (2023).

Introduction to bioimaging-based spatial multi-omic novel methods.

Quantitative Biology.

DOI: https://doi.org/10.15302/J-QB-023-0332

seqFISH+의 Pseudocolor 설계와 반복 혼성화 원리, 공간 다중오믹스 분석에서의 활용을 설명한 검토 문헌입니다.

※ 본 글은 공개된 학술논문을 바탕으로 seqFISH+의 원리와 연구 활용을 설명한 교육용 콘텐츠입니다. 원천 연구에서 보고한 유전자 수와 검출 효율은 해당 실험 조건에 관한 결과이며, 모든 검체에서 동일한 성능이 보장되는 것은 아닙니다.