MERFISH 원리: 형광 바코드와 오류 교정으로 수천 종류의 RNA를 구별하는 방법

조직에서 RNA를 분석할 때는 발현량뿐 아니라 어느 세포에 존재하는지도 중요합니다. MERFISH는 여러 차례의 형광 영상과 조합형 바코드를 이용해 다수의 RNA를 구별하는 기술입니다. RNA의 공간적 위치를 유지하면서 발현 정보를 분석하는 원리와 한계를 살펴봅니다.

1. 일반적인 RNA 검출법으로 수천 개 유전자를 분석하기 어려운 이유

RNA는 세포의 기능과 상태를 이해하는 데 중요한 분자입니다.

특정 RNA가 얼마나 많이 발현되는지 확인하면 세포의 전사 활성을 분석할 수 있습니다.

하지만 조직에서 RNA를 추출해 분석하면 RNA가 원래 어느 세포에 존재했는지에 관한 정보가 사라질 수 있습니다.

이를 보완하는 방법이 RNA in situ hybridization(ISH)입니다.

ISH는 조직이나 세포의 형태를 유지하면서 표적 RNA에 probe를 결합시키는 기술입니다.

대표적인 single-molecule FISH(smFISH)는 RNA를 점 형태의 형광 신호로 관찰할 수 있습니다.

그러나 서로 다른 RNA를 각각 별도의 형광 색상으로 표시하려면 동시에 구별할 수 있는 RNA 종류에 제한이 생깁니다.

형광 색상은 서로 겹칠 수 있고, 현미경에서 안정적으로 구분할 수 있는 채널 수도 제한적이기 때문입니다.

MERFISH는 이러한 문제를 해결하기 위해 RNA마다 고유한 형광 바코드를 부여합니다.

2. MERFISH는 어떤 기술일까?

MERFISH는 Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization의 약자입니다.

한국어로는 오류에 강한 다중 형광 제자리 혼성화 기술이라고 설명할 수 있습니다.

이 기술은 2015년 Chen과 연구진이 Science에 발표했습니다.

MERFISH의 핵심은 RNA 종류를 하나의 형광 색상으로 구분하지 않는다는 점입니다.

대신 여러 차례 형광 영상을 촬영하면서 각 RNA가 나타내는 신호 조합을 기록합니다.

예를 들어 특정 RNA가 첫 번째 촬영에서는 형광 신호를 나타내고, 두 번째 촬영에서는 신호가 없으며, 세 번째 촬영에서는 다시 신호를 나타낼 수 있습니다.

이러한 신호 조합을 이진 바코드(Binary Barcode)로 표현합니다.

각 RNA 종류에 서로 다른 바코드를 배정하면 제한된 형광 채널로도 많은 RNA를 구별할 수 있습니다.

3. RNA를 구별하는 이진 바코드의 원리

MERFISH에서는 각 RNA 종류에 고유한 바코드를 부여합니다.

바코드의 각 자리는 형광 신호의 존재 여부를 나타냅니다.

형광 신호가 관찰되면 1, 관찰되지 않으면 0으로 기록할 수 있습니다.

예를 들어 네 번의 관찰에서 다음과 같은 결과가 나왔다고 가정하겠습니다.

RNA 종류	1회차	2회차	3회차	4회차	바코드
RNA A	1	0	1	0	1010
RNA B	0	1	1	0	0110
RNA C	1	1	0	1	1101

각 RNA는 서로 다른 바코드를 가지고 있습니다.

따라서 동일한 형광 색상을 반복 사용하더라도 관찰 회차별 신호를 조합하면 RNA 종류를 구별할 수 있습니다.

이 표는 원리를 설명하기 위한 가상 사례입니다.

실제 MERFISH에서는 오류 검출과 교정을 위해 바코드 사이의 차이를 충분히 확보하도록 설계합니다.

따라서 가능한 모든 이진 조합을 RNA에 배정하는 것은 아닙니다.

4. Encoding Probe와 Readout Probe의 역할

MERFISH에서는 일반적으로 두 종류의 probe가 사용됩니다.

첫 번째는 Encoding Probe입니다.

Encoding Probe는 표적 RNA에 결합하는 서열과 바코드 정보를 나타내는 readout 서열을 포함합니다.

두 번째는 Readout Probe입니다.

Readout Probe는 Encoding Probe에 포함된 특정 readout 서열에 결합합니다.

이때 Readout Probe에는 형광물질이 연결돼 있습니다.

따라서 특정 readout 서열을 가진 RNA만 해당 촬영 회차에서 형광 신호를 나타낼 수 있습니다.

예를 들어 RNA A에 1010이라는 바코드가 부여됐다고 가정하겠습니다.

첫 번째와 세 번째 readout 서열에 대응하는 형광 probe가 결합하면 RNA A는 해당 회차에서 신호를 나타냅니다.

반면 두 번째와 네 번째 회차에서는 신호가 나타나지 않습니다.

이러한 결과를 여러 회차에 걸쳐 수집하면 RNA A의 바코드를 읽을 수 있습니다.

5. MERFISH는 어떤 단계로 진행될까?

대표적인 MERFISH 분석은 다음과 같은 과정으로 구성됩니다.

① 세포 또는 조직 검체를 준비하고 RNA를 보존합니다.

② 여러 종류의 표적 RNA에 Encoding Probe를 결합시킵니다.

③ 첫 번째 Readout Probe를 반응시켜 형광 영상을 촬영합니다.

④ 형광 신호를 제거하거나 비활성화합니다.

⑤ 다음 Readout Probe를 반응시켜 다시 영상을 촬영합니다.

⑥ 필요한 횟수만큼 형광 검출을 반복합니다.

⑦ 같은 위치에서 관찰된 신호를 조합해 RNA 바코드를 판독합니다.

⑧ RNA의 종류와 위치, 세포별 검출 수를 분석합니다.

이 과정에서 중요한 것은 서로 다른 촬영 회차의 영상을 정확하게 정렬하는 것입니다.

영상 위치가 조금만 달라져도 동일한 RNA 분자의 신호를 서로 다른 위치의 신호로 잘못 인식할 수 있습니다.

따라서 영상 정합(Image Registration)은 MERFISH 분석의 중요한 품질관리 과정입니다.

6. MERFISH에서 오류 교정이 필요한 이유

MERFISH는 여러 차례 형광 신호를 측정합니다.

그러나 모든 촬영에서 신호가 완벽하게 검출되는 것은 아닙니다.

대표적인 오류는 두 가지입니다.

첫 번째는 실제로 형광 신호가 있어야 하는 위치에서 신호가 검출되지 않는 경우입니다.

이를 1-to-0 오류라고 합니다.

두 번째는 원래 신호가 없어야 하는 위치에서 형광 신호가 관찰되는 경우입니다.

이를 0-to-1 오류라고 합니다.

이러한 오류가 발생하면 RNA의 바코드가 원래 설계된 값과 달라질 수 있습니다.

예를 들어 RNA A의 실제 바코드가 1010인데 세 번째 회차의 신호가 누락되면 1000으로 기록될 수 있습니다.

이때 1000이라는 바코드가 다른 RNA에 배정돼 있다면 RNA를 잘못 식별할 위험이 있습니다.

MERFISH는 이러한 문제를 줄이기 위해 오류에 강한 바코드 체계를 사용합니다.

7. Hamming Distance는 무엇을 의미할까?

MERFISH의 오류 교정 원리를 이해하려면 Hamming Distance를 알아야 합니다.

Hamming Distance는 길이가 같은 두 바코드에서 서로 다른 자리의 개수를 의미합니다.

예를 들어 다음 두 바코드를 비교하겠습니다.

• 바코드 A: 101010
• 바코드 B: 010101

두 바코드는 여섯 자리 모두 다릅니다.

따라서 Hamming Distance는 6입니다.

반면 다음 두 바코드를 비교하면 차이가 한 자리뿐입니다.

• 바코드 C: 101010
• 바코드 D: 101011

이 경우 Hamming Distance는 1입니다.

바코드 사이의 Hamming Distance가 크면 일부 신호 오류가 발생하더라도 원래 RNA를 구별하기 쉬워집니다.

일반적인 오류 교정 코드에서는 최소 Hamming Distance가 4인 경우 한 자리 오류를 교정하고 두 자리까지의 오류를 검출할 수 있습니다.

다만 실제 오류 교정 가능 범위는 바코드 설계와 판독 규칙에 따라 달라집니다.

8. 2015년 원천 연구에서는 무엇을 확인했을까?

2015년 Chen과 연구진은 MERFISH를 이용해 단일세포에서 다수의 RNA를 동시에 분석했습니다.

연구진은 오류에 강한 바코드 체계를 적용해 100~1,000종류의 RNA를 영상 기반으로 검출하는 방법을 제시했습니다.

특히 16비트 바코드와 오류 교정 체계를 이용한 실험에서는 140종류의 RNA를 분석했습니다.

해당 조건에서 약 80%의 검출 효율을 보고했습니다.

또한 오류 검출에 초점을 맞춘 다른 바코드 체계를 이용해 1,000종류의 RNA를 분석했으며, 이 경우 약 30%의 검출 효율을 보고했습니다.

이 결과는 바코드 설계와 검출 효율 사이에 절충 관계가 존재한다는 점을 보여줍니다.

RNA 종류를 많이 분석한다고 해서 모든 RNA를 동일한 효율로 검출할 수 있는 것은 아닙니다.

따라서 MERFISH 결과를 해석할 때는 분석 대상 RNA 수뿐 아니라 검출 효율과 오류율을 함께 확인해야 합니다. <Cite ref=”turn391988search0″/>

9. 2016년 연구에서 개선된 분석 처리량

2016년 Moffitt와 연구진은 PNAS에 MERFISH의 분석 처리량을 개선한 연구를 발표했습니다.

기존 MERFISH에서는 반복 촬영 사이에 형광 신호를 제거하기 위해 photobleaching을 사용했습니다.

그러나 photobleaching에는 시간이 필요합니다.

특히 넓은 영역을 촬영할수록 신호 제거에 필요한 시간이 증가할 수 있습니다.

연구진은 이러한 제한을 줄이기 위해 형광물질을 화학적으로 제거하는 방법을 도입했습니다.

또한 한 번에 촬영하는 영역을 넓히고 여러 형광 채널을 활용했습니다.

그 결과 분석 처리량을 약 100배 높였다고 보고했습니다.

개선된 방법을 이용해 약 10만 개의 사람 세포에서 130개 유전자의 발현을 분석했습니다.

또한 약 18시간의 측정으로 약 4만 개 세포를 분석할 수 있음을 제시했습니다.

이러한 결과는 MERFISH가 소수의 세포뿐 아니라 비교적 큰 세포 집단의 공간적 발현 분석에도 활용될 수 있음을 보여줍니다.

다만 이 처리량은 해당 연구의 장비와 검체, 유전자 패널 및 영상 조건에서 얻은 결과입니다. <Cite ref=”turn391988search1″/>

10. MERFISH에서 형광 신호를 반복해서 사용하는 방법

MERFISH는 같은 검체에서 여러 차례 형광 영상을 촬영합니다.

따라서 이전 촬영에서 발생한 신호를 제거하는 과정이 중요합니다.

초기 MERFISH에서는 photobleaching을 이용했습니다.

Photobleaching은 강한 빛을 조사해 형광물질의 발광 능력을 감소시키는 방법입니다.

그러나 넓은 영역을 반복 촬영할 때 시간이 오래 걸릴 수 있습니다.

2016년 연구에서는 형광물질과 Readout Probe 사이에 절단 가능한 화학적 연결 구조를 도입했습니다.

연구진은 환원제를 이용해 형광물질을 제거하는 방법을 사용했습니다.

이러한 방식은 검체 전체에서 형광 신호를 동시에 제거할 수 있다는 장점이 있습니다.

하지만 모든 MERFISH 프로토콜이 동일한 신호 제거 방법을 사용하는 것은 아닙니다.

실험 설계에 따라 photobleaching이나 화학적 절단 등 서로 다른 방법을 사용할 수 있습니다.

11. MERFISH와 RNAscope는 무엇이 다를까?

MERFISH와 RNAscope는 모두 조직 또는 세포에서 RNA의 위치를 분석할 수 있습니다.

하지만 RNA를 구별하고 신호를 생성하는 방식이 다릅니다.

비교 항목	MERFISH	RNAscope
핵심 원리	조합형 바코드와 반복 형광 영상	Double-Z Probe와 단계적 신호 증폭
RNA 구별 방식	여러 촬영 회차의 신호 조합	표적별 probe와 검출 표지
다중 분석	대규모 RNA 패널 분석 가능	검사 형식에 따라 여러 RNA 동시 분석
공간 정보	세포 및 세포 내 RNA 위치	조직 및 세포 내 RNA 위치
주요 장점	많은 RNA를 동시에 구별	조직 형태를 유지한 표적 RNA 검출
주요 제한	반복 영상과 바코드 판독 오류	검출 채널 및 신호 중첩 문제

MERFISH는 많은 종류의 RNA를 동시에 분석하도록 설계됐습니다.

반면 RNAscope는 선택한 RNA의 조직 내 발현을 확인하는 데 널리 활용됩니다.

따라서 두 기술은 분석 목적에 따라 서로 다른 장점을 제공합니다.

12. MERFISH와 단일세포 RNA-seq의 차이

단일세포 RNA-seq(scRNA-seq)은 세포별 RNA 발현을 분석하는 대표적인 기술입니다.

그러나 일반적인 scRNA-seq에서는 조직을 단일세포로 분리해야 합니다.

이 과정에서 세포가 원래 조직의 어느 위치에 존재했는지에 관한 정보가 사라질 수 있습니다.

반면 MERFISH는 세포나 조직의 위치 정보를 유지하면서 RNA를 분석합니다.

따라서 특정 RNA를 발현하는 세포가 다른 세포와 어떤 공간적 관계를 가지는지 평가할 수 있습니다.

그러나 MERFISH는 일반적으로 미리 선택한 RNA 패널을 분석합니다.

반면 scRNA-seq은 실험 설계와 시퀀싱 깊이에 따라 더 넓은 전사체 정보를 탐색할 수 있습니다.

따라서 MERFISH가 모든 상황에서 scRNA-seq을 대체하는 것은 아닙니다.

두 기술을 함께 활용하면 세포 종류의 분류와 조직 내 위치 정보를 보완할 수 있습니다.

13. MERFISH에서 RNA 개수를 어떻게 계산할까?

MERFISH에서는 각 RNA 분자에 해당하는 형광 신호의 위치와 바코드를 분석합니다.

예를 들어 특정 세포에서 RNA A에 해당하는 바코드가 20개 검출됐다고 가정하겠습니다.

이 경우 해당 세포에서 RNA A에 해당하는 20개의 분자 신호가 관찰됐다고 설명할 수 있습니다.

그러나 실제 RNA 분자 수가 반드시 정확히 20개라는 의미는 아닙니다.

일부 RNA는 probe 결합이나 영상 판독 과정에서 검출되지 않을 수 있습니다.

반대로 배경 신호가 잘못 판독되면 RNA 수가 과대평가될 수 있습니다.

따라서 MERFISH의 RNA 개수는 검출 효율과 오류율을 고려해 해석해야 합니다.

특히 서로 다른 RNA 종류를 비교할 때는 probe 설계와 검출 효율의 차이를 고려해야 합니다.

14. 가상의 MERFISH 데이터 해석 사례

세 가지 세포 집단에서 특정 RNA의 발현을 분석했다고 가정하겠습니다.

세포 집단	RNA A 평균 검출 수	RNA B 평균 검출 수	RNA C 평균 검출 수
세포 집단 1	30	5	2
세포 집단 2	4	25	8
세포 집단 3	3	7	28

이 결과에서는 세포 집단 1에서 RNA A가 상대적으로 많이 검출됐습니다.

세포 집단 2에서는 RNA B가, 세포 집단 3에서는 RNA C가 상대적으로 많이 검출됐습니다.

이러한 패턴은 서로 다른 세포 집단의 전사 특성을 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

그러나 RNA A가 많이 검출됐다는 이유만으로 세포 집단 1의 종류를 확정할 수는 없습니다.

세포 종류를 분류하려면 여러 유전자의 발현 조합과 기존 세포 표지 정보를 함께 분석해야 합니다.

또한 검출 수의 차이가 통계적으로 의미 있는지 평가하려면 충분한 세포 수와 반복 실험이 필요합니다.

이 표는 분석 원리를 설명하기 위한 가상 사례입니다.

15. MERFISH에서 위양성이 발생하는 원인

MERFISH는 오류 교정 바코드를 사용하지만 모든 오류를 제거할 수는 없습니다.

대표적인 위양성 원인은 다음과 같습니다.

비특이적 Probe 결합

Encoding Probe가 표적이 아닌 RNA에 결합하면 잘못된 신호가 발생할 수 있습니다.

영상 정합 오류

서로 다른 촬영 회차의 영상이 정확하게 정렬되지 않으면 다른 위치의 신호가 하나의 바코드로 조합될 수 있습니다.

형광 배경 신호

조직 자가형광이나 비특이적 형광 신호가 바코드 판독에 영향을 줄 수 있습니다.

신호 중첩

RNA가 밀집된 영역에서는 서로 다른 분자의 형광 신호가 겹쳐 보일 수 있습니다.

이러한 문제는 RNA의 위치와 개수를 잘못 판독하는 원인이 될 수 있습니다.

따라서 MERFISH 분석에서는 바코드 오류율뿐 아니라 영상 품질과 세포 분할 정확도를 함께 확인해야 합니다.

16. Blank Barcode가 중요한 이유

MERFISH에서는 실제 RNA에 배정하지 않은 바코드를 대조군으로 사용할 수 있습니다.

이를 Blank Barcode라고 합니다.

Blank Barcode는 어떤 RNA에도 대응하지 않도록 설계됩니다.

따라서 정상적인 분석에서는 Blank Barcode에 해당하는 신호가 거의 나타나지 않아야 합니다.

만약 Blank Barcode가 자주 검출된다면 바코드 판독 오류나 배경 신호를 검토해야 합니다.

2016년 연구에서도 실제 RNA에 배정한 바코드와 Blank Barcode의 검출 결과를 비교해 분석 성능을 평가했습니다.

이러한 대조군은 단순히 형광 신호가 존재하는지 확인하는 것보다 바코드 판독의 신뢰성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

다만 Blank Barcode 신호가 적다는 사실만으로 모든 RNA의 검출 효율이 높다고 확정할 수는 없습니다.

검출 누락은 별도의 품질관리 지표로 평가해야 합니다.

17. MERFISH에서 세포 분할이 중요한 이유

MERFISH는 RNA의 위치를 분석할 수 있지만, RNA가 어느 세포에 속하는지 구분하는 과정이 필요합니다.

이를 Cell Segmentation이라고 합니다.

일반적으로 세포핵이나 세포 경계를 나타내는 영상 정보를 이용해 세포 영역을 구분합니다.

그다음 각 RNA 신호를 해당 세포에 배정합니다.

그러나 세포가 밀집된 조직에서는 세포 경계를 정확하게 구별하기 어려울 수 있습니다.

특히 세포질이 길게 뻗어 있거나 서로 겹친 세포에서는 RNA가 잘못된 세포에 배정될 가능성이 있습니다.

따라서 MERFISH의 세포별 발현 분석에서는 RNA 바코드 판독뿐 아니라 세포 분할의 정확성이 중요합니다.

18. MERFISH의 분자진단적 활용 가능성

MERFISH는 세포별 RNA 발현과 공간적 위치를 동시에 분석할 수 있습니다.

따라서 종양 조직에서 서로 다른 세포 집단의 발현 특성을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

예를 들어 종양 주변 면역세포의 분포와 특정 유전자 발현 패턴을 함께 분석할 수 있습니다.

또한 정상 조직과 질환 조직 사이에서 세포 집단의 구성과 위치 관계가 어떻게 달라지는지 평가할 수 있습니다.

이러한 정보는 질환 관련 바이오마커를 탐색하는 데 도움이 됩니다.

그러나 MERFISH에서 특정 RNA 발현 패턴이 관찰됐다는 사실만으로 질환을 진단할 수는 없습니다.

임상 검사로 활용하려면 검체 처리와 영상 분석, 바코드 판독, 세포 분할 및 판정 기준에 대한 검증이 필요합니다.

따라서 MERFISH는 현재 일반적인 확진 검사보다 공간 전사체 연구와 바이오마커 탐색에 활용되는 기술로 이해하는 것이 적절합니다.

19. MERFISH의 분석적 가치와 한계

MERFISH는 조합형 형광 바코드를 이용해 많은 종류의 RNA를 동시에 구별하는 기술입니다.

2015년 원천 연구에서는 100~1,000종류의 RNA를 단일세포에서 분석할 수 있음을 제시했습니다.

또한 오류 교정 바코드를 이용해 형광 신호의 누락과 잘못된 검출을 줄이는 방법을 설명했습니다.

2016년 후속 연구에서는 형광 신호 제거 방법과 영상 촬영 조건을 개선해 분석 처리량을 높였습니다.

이러한 특징은 세포별 RNA 발현뿐 아니라 조직 내 위치 관계를 분석하는 데 도움이 됩니다.

그러나 MERFISH는 probe 설계와 영상 정합, 바코드 판독, 세포 분할의 영향을 받습니다.

또한 검출된 RNA 개수가 실제 RNA 분자 수와 정확히 일치한다고 가정해서는 안 됩니다.

따라서 MERFISH 결과를 해석할 때는 검출 효율과 오류율, 대조군 결과를 함께 확인해야 합니다.

MERFISH의 핵심적인 가치는 제한된 형광 채널을 조합형 바코드로 확장해 다수의 RNA를 공간적 위치와 함께 분석할 수 있다는 점입니다.

이는 RNA 발현량과 조직 내 세포 위치를 연결하는 데 중요한 정보를 제공하지만, 특정 RNA 발현 패턴만으로 질환의 원인을 확정하는 기술과는 구별해야 합니다.

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참고문헌

1. Chen KH, Boettiger AN, Moffitt JR, Wang S, Zhuang X. (2015).

Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells.

Science, 348(6233), aaa6090.

DOI: https://doi.org/10.1126/science.aaa6090

MERFISH의 원리를 제시하고 오류 교정 바코드를 이용해 100~1,000종류의 RNA를 단일세포에서 분석한 원천 연구입니다.

2. Moffitt JR, Hao J, Wang G, Chen KH, Babcock HP, Zhuang X. (2016).

High-throughput single-cell gene-expression profiling with multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization.

Proceedings of the National Academy of Sciences, 113(39), 11046–11051.

DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1612826113

형광 신호 제거와 영상 촬영 방법을 개선해 MERFISH의 분석 처리량을 높인 연구입니다.

3. Chen KH, Boettiger AN, Moffitt JR, Wang S, Zhuang X. (2015). 원천 연구 공개 전문.

PubMed Central: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4662681/

MERFISH의 Encoding Probe와 Readout Probe 설계, 바코드 오류 교정 및 단일세포 RNA 검출 결과를 상세하게 확인할 수 있습니다.

4. Moffitt JR, Hao J, Wang G, et al. (2016). 후속 연구 공개 전문.

PubMed Central: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC5047202/

고처리량 MERFISH의 반복 영상 분석과 형광 신호 제거, Blank Barcode 기반 품질관리 방법을 설명한 자료입니다.

※ 본 글은 공개된 학술논문을 바탕으로 MERFISH의 원리와 연구 활용을 설명한 교육용 콘텐츠입니다. RNA 검출 수와 오류율은 실험 조건 및 바코드 설계에 따라 달라질 수 있으며, 특정 발현 패턴만으로 질환을 확정해서는 안 됩니다.