SDA·EXPAR·RCA를 연계한 let-7d miRNA 다중 증폭 검출 기술

하나의 miRNA를 검출하기 위해 여러 등온 핵산 증폭 반응을 연속으로 연결한 연구가 있습니다. 이번 글에서는 SDA, EXPAR, RCA를 함께 이용한 let-7d 검출 원리를 살펴보겠습니다.

여러 등온 핵산 증폭 기술을 하나의 검출법에 적용하다

분자진단 연구에서는 하나의 핵산 증폭 기술만 사용하는 것이 아니라 서로 다른 원리를 가진 반응을 연결하는 경우도 있습니다.

특히 최근에는 등온 핵산 증폭 기술을 CRISPR-Cas system이나 다양한 signal amplification 방식과 함께 사용하는 연구가 이루어지고 있습니다.

이번에 살펴볼 논문은 조금 다른 구성을 가지고 있습니다.

표적 miRNA를 검출하기 위해 Strand Displacement Amplification(SDA), Exponential Amplification Reaction(EXPAR), Rolling Circle Amplification(RCA)​을 연속적으로 사용했습니다.

각 반응은 독립적으로 핵산을 증폭하는 기술이지만 이 연구에서는 앞 단계에서 생성된 산물이 다음 증폭반응의 시작 물질이 되도록 연결했습니다.

따라서 하나의 miRNA가 여러 단계의 amplification을 거치면서 최종적으로 강한 fluorescence signal로 변환됩니다.

논문에서 선택한 표적은 let-7d miRNA

논문에서는 먼저 검출 대상인 microRNA(miRNA)의 특징을 설명합니다.

miRNA는 약 18~25 nucleotide로 구성된 짧은 single-stranded RNA이며 세포 내에서 유전자 발현을 조절하는 역할을 합니다.

특정 miRNA의 발현 변화가 여러 질환과 관련되어 있다는 연구가 진행되면서 암과 관련된 biomarker 후보로도 주목받고 있습니다.

하지만 miRNA는 길이가 매우 짧고 서로 비슷한 sequence를 가진 family가 많기 때문에 선택적으로 검출하는 것이 쉽지 않습니다.

이번 연구에서는 여러 let-7 miRNA family 가운데 let-7d를 표적 핵산으로 선택했습니다.

Let-7 family는 다양한 암 조직과 세포에서 연구되고 있는 miRNA 가운데 하나이기 때문에 저자들은 새로운 amplification assay를 평가하기 위한 표적으로 활용했습니다.

기존 miRNA 분석 기술에서 제시한 한계

논문에서는 기존 miRNA 분석 방법도 함께 설명합니다.

Northern blotting은 miRNA를 분석하는 전통적인 방법 가운데 하나지만 여러 처리 과정이 필요해 시간이 오래 걸릴 수 있습니다.

Microarray는 많은 종류의 miRNA를 동시에 분석할 수 있다는 장점이 있지만 표적에 labeling을 하거나 미리 probe를 고정해야 하는 과정이 필요합니다.

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR) 역시 miRNA 분석에 많이 활용됩니다.

하지만 miRNA처럼 매우 짧은 핵산은 일반적인 긴 RNA와 동일한 방식으로 증폭하기 어렵기 때문에 별도의 primer와 protocol 설계가 필요합니다.

이러한 이유로 연구진은 일정한 온도에서 반응할 수 있는 isothermal nucleic acid amplification을 대안으로 소개합니다.

대표적으로 LAMP, EXPAR, RCA, SDA 등이 있으며 이번 연구에서는 이 가운데 여러 방식을 하나의 검출 시스템 안에 연결했습니다.

첫 번째 단계는 S1 Hairpin과 표적 miRNA의 결합

검출 반응은 표적 let-7d가 S1 probe와 결합하면서 시작됩니다.

S1은 hairpin 형태를 가진 핵산입니다.

Hairpin 구조는 크게 loop와 stem으로 구분할 수 있습니다.

Stem 영역에는 서로 상보적인 sequence가 있어 내부적으로 결합된 상태를 유지하고, loop 영역은 single-stranded 상태로 노출되어 있습니다.

표적 miRNA가 S1의 노출된 영역과 상보적으로 결합하면 hairpin 구조가 열리기 시작합니다.

그 결과 원래 서로 결합하고 있던 stem 영역의 일부가 외부에 노출됩니다.

이렇게 새롭게 노출된 sequence가 다음 단계의 반응을 시작할 수 있는 자리가 됩니다.

S2가 Primer 역할을 하면서 SDA가 시작된다

S1 hairpin이 표적 miRNA에 의해 열리면 S2 strand가 노출된 영역에 결합합니다.

논문의 모식도에서 밝은 파란색으로 표현된 S2는 이후 DNA synthesis를 위한 primer 역할을 담당합니다.

S2가 결합하면 Klenow polymerase에 의해 새로운 DNA strand가 합성됩니다.

이 과정에서 처음 S1과 결합하고 있던 target miRNA는 새롭게 합성되는 strand에 의해 밀려나게 됩니다.

여기에서 중요한 것이 DNA polymerase의 strand displacement activity입니다.

새로운 DNA를 합성하면서 기존에 결합되어 있던 strand를 밀어낼 수 있기 때문에 표적 miRNA가 S1에서 떨어져 나올 수 있습니다.

방출된 miRNA는 반응에서 소모되지 않고 다시 다른 S1 hairpin에 결합할 수 있습니다.

따라서,

miRNA가 S1을 열고

→ S2가 결합하고

→ DNA Polymerase가 연장하고

→ miRNA가 다시 방출되는

반응이 반복될 수 있습니다.

이것이 논문에서 활용한 SDA 기반 첫 번째 signal amplification입니다.

Strand Displacement에 적합한 Polymerase가 필요한 이유

모든 DNA polymerase가 동일한 특성을 갖는 것은 아닙니다.

DNA polymerase 가운데에는 proofreading을 위한 exonuclease activity를 가진 효소도 있고, 특정 기능이 제거되거나 약화된 형태도 있습니다.

이번 반응에서는 새로운 DNA strand를 합성하면서 기존에 결합해 있는 strand를 밀어낼 수 있는 strand-displacing polymerase activity가 중요합니다.

연구에서 사용한 Klenow polymerase 역시 이러한 DNA synthesis와 strand displacement를 이용해 target miRNA를 다시 방출하는 데 사용됩니다.

따라서 첫 번째 증폭 단계의 핵심은 target을 단순히 복제하는 것이 아니라 하나의 miRNA가 여러 S1 probe를 연속적으로 활성화할 수 있도록 recycling하는 구조라고 볼 수 있습니다.

생성된 DNA가 다음 EXPAR 반응을 시작한다

S2가 primer로 작용해 DNA synthesis가 진행되면 긴 double-stranded DNA 영역이 만들어집니다.

이 DNA에는 nicking enzyme이 인식할 수 있는 sequence가 포함되어 있습니다.

Nicking enzyme은 double-stranded DNA 전체를 절단하는 restriction enzyme과 달리 특정 strand에 nick을 만들 수 있습니다.

이 nick이 만들어진 후 DNA polymerase가 절단된 지점에서 다시 DNA synthesis를 시작합니다.

새로운 strand가 만들어지면서 뒤쪽에 위치해 있던 짧은 핵산이 strand displacement에 의해 떨어져 나갑니다.

논문에서는 이렇게 생성된 핵산을 EXPAR product 1로 설명합니다.

Nicking enzyme이 다시 recognition site를 인식할 수 있기 때문에 nicking과 polymerization이 반복됩니다.

결과적으로 동일한 EXPAR product 1이 지속적으로 생성될 수 있습니다.

EXPAR Product 1이 두 번째 증폭 Template를 활성화한다

첫 번째 EXPAR 반응에서 생성된 product 1은 다음 단계에서 S5와 결합합니다.

Product 1이 S5의 상보적인 sequence와 hybridization하면 다시 DNA polymerase가 DNA를 합성합니다.

그 결과 새로운 double-stranded DNA structure가 만들어집니다.

여기에도 nicking enzyme recognition site가 포함되어 있습니다.

따라서 첫 번째 EXPAR 반응과 유사하게

Nicking

→ DNA Polymerase Extension

→ Strand Displacement

반응이 반복됩니다.

이 과정을 통해 새로운 짧은 핵산 산물이 지속적으로 생성됩니다.

논문에서는 이를 EXPAR product 2로 구분합니다.

결국 하나의 EXPAR reaction만 존재하는 것이 아니라 product 1이 다시 다른 template를 활성화하고 product 2를 생성하는 연속적인 amplification structure가 구성되어 있습니다.

왜 이 반응을 EXPAR 관점에서 볼 수 있을까?

논문에서는 전체 기술을 설명하면서 SDA와 RCA를 주요 amplification method로 제시하고 있습니다.

하지만 실제 모식도를 보면 중간 단계에서는 nicking enzyme과 strand-displacing DNA polymerase가 반복적으로 작용하면서 짧은 핵산 산물을 계속 만들어냅니다.

이는 EXPAR에서 사용되는 핵심적인 amplification mechanism과 밀접하게 연결됩니다.

따라서 이 기술을 이해할 때 단순히

SDA + RCA

두 가지 반응만 연결됐다고 보기보다,

SDA → EXPAR 형태의 반복 증폭 → RCA

라는 관점으로 살펴보면 중간 단계에서 어떻게 많은 product가 만들어지는지 이해하기 쉽습니다.

특히 EXPAR product 1과 product 2가 각각 다음 반응을 활성화하도록 설계되어 있다는 점이 이 논문에서 흥미로운 부분입니다.

EXPAR Product 2가 RCA의 Primer가 된다

두 번째 EXPAR 과정에서 만들어진 product 2는 다음 단계에서 Circular Template(CT)​과 결합합니다.

Circular template는 이미 원형으로 만들어져 반응에 포함되어 있습니다.

Product 2가 CT와 상보적으로 결합하면 이제 product 2가 RCA를 시작하는 primer 역할을 할 수 있습니다.

여기에 Phi29 DNA polymerase가 작용합니다.

Phi29 polymerase는 강한 strand displacement activity를 가지며 circular DNA를 template로 이용해 매우 긴 single-stranded DNA를 합성할 수 있습니다.

Polymerase는 원형 template를 한 번만 복제하고 멈추지 않습니다.

같은 circle을 여러 번 반복해서 따라가면서 CT sequence에 상보적인 DNA를 연속적으로 생성합니다.

따라서 하나의 EXPAR product 2가 매우 긴 RCA product 생성으로 연결됩니다.

RCA Product에는 G-Quadruplex Sequence가 반복된다

이번 논문에서 RCA는 단순히 긴 DNA를 만드는 용도로만 사용되지 않습니다.

Circular template에는 G-quadruplex를 형성할 수 있는 sequence 정보가 포함되어 있습니다.

따라서 Phi29 polymerase가 CT를 반복적으로 복제하면 생성된 긴 single-stranded DNA 안에 G-rich sequence 역시 반복적으로 포함됩니다.

이러한 G-rich sequence는 적절한 조건에서 G-quadruplex structure를 형성할 수 있습니다.

결과적으로 RCA가 많이 진행될수록 하나의 긴 DNA 안에 여러 개의 G-quadruplex structure가 만들어질 수 있습니다.

이 구조가 최종 fluorescence detection의 기반이 됩니다.

NMM을 이용해 G-Quadruplex를 형광으로 검출한다

연구진은 RCA product를 검출하기 위해 N-methyl mesoporphyrin IX(NMM)​를 사용했습니다.

NMM은 특정 G-quadruplex structure와 상호작용했을 때 fluorescence가 크게 증가할 수 있는 물질입니다.

따라서 표적 let-7d가 존재하면 앞선 SDA와 EXPAR 반응이 진행되고 최종적으로 많은 EXPAR product 2가 만들어집니다.

Product 2는 RCA primer가 되고, Phi29 polymerase에 의해 G-quadruplex sequence가 반복적으로 포함된 긴 DNA가 생성됩니다.

여기에 NMM을 첨가하면 G-quadruplex와 상호작용하면서 fluorescence signal이 증가합니다.

전체 반응을 연결하면 다음과 같습니다.

let-7d

→ S1 Hairpin Opening

→ S2 결합

→ SDA

→ EXPAR Product 1 생성

→ S5 활성화

→ EXPAR Product 2 생성

→ Circular Template 결합

→ Phi29 기반 RCA

→ G-Quadruplex 반복 생성

→ NMM 결합

→ Fluorescence 증가

하나의 miRNA 신호가 여러 amplification 단계를 거쳐 최종 형광으로 변환되는 구조입니다.

여러 단계의 증폭을 연결한 이유

이 논문의 특징은 서로 다른 amplification mechanism을 한 번씩 사용하는 데 그치지 않는다는 점입니다.

첫 번째 단계에서는 target miRNA가 S1 hairpin을 열고 strand displacement를 통해 다시 방출됩니다.

따라서 하나의 target이 반복적으로 새로운 S1을 활성화할 수 있습니다.

다음 단계에서는 nicking enzyme과 DNA polymerase의 반복적인 작용을 통해 EXPAR product 1과 product 2가 대량으로 생성됩니다.

마지막으로 product 2 하나가 RCA primer가 되어 매우 긴 DNA를 만들어냅니다.

이를 정리하면,

Target Recycling

→ Nicking 기반 Exponential Amplification

→ Rolling Circle Amplification

이라는 여러 단계의 signal amplification이 연결된 것입니다.

최종적으로 RCA product에는 다수의 G-quadruplex가 존재하기 때문에 NMM fluorescence까지 추가로 증가시킬 수 있습니다.

반응 조건을 최적화해 검출 효율을 높이다

여러 enzyme reaction이 연결된 기술에서는 각 단계의 조건이 전체 성능에 영향을 줄 수 있습니다.

연구진은 이러한 점을 고려해 여러 요소에 대한 optimization을 진행했습니다.

대표적으로 nicking enzyme과 DNA polymerase의 농도를 조절하고 전체 반응시간과 NMM 농도 등도 비교했습니다.

이러한 조건을 최적화한 결과 논문에서는 1.5 × 10⁻¹³ M 수준의 detection limit을 제시했습니다.

또한 let-7d와 sequence가 유사한 다른 let-7 family miRNA를 이용해 specificity를 비교했습니다.

그 결과 연구진은 해당 assay가 유사한 miRNA가 존재하는 조건에서도 표적 let-7d를 구별할 수 있음을 확인했습니다.

짧고 sequence similarity가 높은 miRNA family를 대상으로 한다는 점을 고려하면 이러한 specificity 평가 역시 중요한 실험입니다.

이 논문에서 주목할 부분

이번 논문은 하나의 등온 핵산 증폭 기술만을 이용해 miRNA를 검출한 연구와는 구조가 다릅니다.

먼저 let-7d가 S1 hairpin을 열면서 strand displacement reaction을 시작합니다.

이어 S2가 primer 역할을 하고 DNA polymerase가 새로운 strand를 합성하면서 target miRNA가 다시 방출됩니다.

그 뒤에는 nicking enzyme과 polymerase에 의해 EXPAR 형태의 반복적인 amplification이 일어나 product 1과 product 2가 만들어집니다.

마지막 product 2는 circular template에 결합해 RCA를 시작하고, Phi29 polymerase가 G-quadruplex sequence를 반복적으로 포함하는 긴 ssDNA를 합성합니다.

최종적으로 NMM이 G-quadruplex와 상호작용하면서 fluorescence가 증가합니다.

즉,

SDA의 Target Recycling

+ EXPAR의 반복적인 짧은 핵산 생성

+ RCA의 긴 반복 DNA 생성

+ G-Quadruplex/NMM 형광 신호

를 하나의 검출 시스템 안에서 연속적으로 연결한 것입니다.

다중 증폭 기술을 이용한 연구가 보여주는 점

여러 amplification 기술을 함께 사용한다고 해서 반드시 더 좋은 검출법이 만들어지는 것은 아닙니다.

반응 단계가 많아질수록 사용되는 enzyme과 probe가 증가하고 각각의 반응 조건을 동시에 맞춰야 하는 어려움도 생길 수 있습니다.

반대로 서로 다른 amplification mechanism이 적절하게 연결된다면 앞 단계의 작은 신호를 다음 단계에서 계속 확장할 수 있다는 장점이 있습니다.

이번 논문에서는 SDA, EXPAR, RCA가 각각 독립적으로 존재하는 것이 아니라 앞 단계에서 생성된 핵산이 다음 amplification의 trigger나 primer가 되도록 설계했습니다.

특히 짧은 let-7d를 출발점으로 여러 번의 strand displacement와 nicking reaction을 거친 뒤 최종적으로 RCA와 G-quadruplex fluorescence까지 연결했다는 점이 흥미롭습니다.

하나의 miRNA를 검출하기 위해 서로 다른 등온 핵산 증폭 원리를 어떻게 조합할 수 있는지 보여준 사례라는 점에서, SDA와 EXPAR 그리고 RCA의 작동 원리를 함께 이해하는 데 도움이 되는 연구라고 볼 수 있습니다.

※ 이 글은 SDA, EXPAR, RCA 및 G-quadruplex/NMM을 이용한 miRNA 검출 연구를 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다.