PAM 제한을 우회하는 Asymmetric RPA와 CRISPR-Cas12a 핵산 검출 기술

CRISPR-Cas12a는 핵산 검출에 유용하지만 dsDNA를 인식할 때 PAM 서열의 영향을 받습니다. 이번 글에서는 asymmetric RPA로 ssDNA를 생성해 이러한 제한을 줄인 연구를 살펴보겠습니다.

RPA와 CRISPR-Cas12a를 함께 사용하는 이유

Recombinase Polymerase Amplification(RPA)은 일정한 온도에서 DNA를 증폭할 수 있는 대표적인 등온 핵산 증폭 기술입니다.

일반적인 PCR처럼 반복적인 온도 변화를 필요로 하지 않으며 비교적 짧은 시간 동안 표적 DNA를 증폭할 수 있다는 특징이 있습니다.

RPA에서 일반적으로 생성되는 주요 amplification product는 double-stranded DNA(dsDNA)입니다.

이러한 특성 때문에 RPA는 CRISPR-Cas12a 기반 핵산 검출 기술과 함께 자주 연구되고 있습니다.

Cas12a는 crRNA를 이용해 특정 DNA sequence를 인식할 수 있습니다.

표적을 인식해 Cas12a가 활성화되면 주변의 single-stranded DNA reporter를 비특이적으로 절단하는 trans-cleavage activity가 나타납니다.

따라서 RPA가 표적 DNA의 양을 증가시키고 Cas12a가 증폭산물을 인식한 뒤 reporter를 절단하도록 구성하면 높은 수준의 검출 신호를 만들 수 있습니다.

하지만 여기에는 중요한 제약이 하나 존재합니다.

바로 PAM(Protospacer Adjacent Motif)​입니다.

Cas12a의 PAM 의존성이 문제가 되는 이유

Cas12a가 double-stranded DNA를 표적으로 인식하려면 표적 주변에 Cas12a가 인식할 수 있는 적절한 PAM sequence가 필요합니다.

따라서 원하는 DNA sequence가 있다고 해서 모든 위치를 자유롭게 crRNA target으로 설정할 수 있는 것은 아닙니다.

검출하고 싶은 sequence 주변에 적절한 PAM이 없다면 crRNA 위치를 변경하거나 다른 영역을 표적으로 선택해야 할 수 있습니다.

특히 특정 mutation처럼 정확히 한 위치를 구별해야 하는 분석에서는 이러한 PAM requirement가 assay design의 제약으로 작용할 수 있습니다.

이번 논문의 연구진은 여기에서 Cas12a의 또 다른 특성에 주목했습니다.

Cas12a는 single-stranded DNA를 인식하는 경우 dsDNA 인식과 동일한 방식의 PAM requirement를 필요로 하지 않는다는 점입니다.

그렇다면 RPA 과정에서 dsDNA가 아니라 충분한 양의 ssDNA를 만들어낼 수 있다면 Cas12a의 PAM 제한을 우회할 수 있습니다.

연구진은 이를 위해 Asymmetric RPA(Asy-RPA)​를 이용했습니다.

논문에서 결핵균과 LSDV를 함께 다룬 이유

논문의 서론에서는 먼저 감염성 질환과 병원체를 정확하게 구별해야 할 필요성을 설명합니다.

그중 하나로 Mycobacterium tuberculosis를 제시합니다.

결핵 치료에서는 약제 감수성이 중요한데, 항생제 내성을 가진 균주와 wild-type 균주를 구별하지 못하면 적절한 치료 방법을 선택하는 데 어려움이 생길 수 있습니다.

특히 rifampin resistance와 관련된 mutation을 검출하는 것은 약제내성 결핵을 구별하는 데 중요한 유전학적 정보가 될 수 있습니다.

논문에서는 이어 Lumpy Skin Disease Virus(LSDV)​를 소개합니다.

LSDV는 소에 감염되는 바이러스로 발열과 피부 병변 등을 일으킬 수 있습니다.

또한 Sheep Pox Virus(SPPV), Goat Pox Virus(GTPV)와 높은 유전적 유사성을 가지고 있기 때문에 가까운 바이러스 사이에서 특정 sequence를 선택적으로 검출할 수 있는 기술이 필요합니다.

처음 읽으면 결핵균에서 갑자기 LSDV로 대상이 바뀌어 다소 어색하게 느껴질 수 있습니다.

하지만 논문의 실험 설계를 보면 두 표적은 서로 다른 목적을 가지고 있습니다.

연구진은 LSDV를 이용해 PAM이 없는 sequence에서도 Asy-RPA와 Cas12a를 이용해 핵산 검출이 가능한지 확인하고, 이후 Mycobacterium tuberculosis를 이용해 wild type과 mutation을 구별할 수 있는지 평가했습니다.

즉, 서로 다른 병원체를 이용해 이 기술의 PAM-independent detection과 mutation discrimination 가능성을 각각 보여주려는 구성입니다.

Asymmetric RPA는 일반 RPA와 무엇이 다를까?

일반적인 symmetric RPA에서는 forward primer와 reverse primer를 충분한 양으로 넣습니다.

두 primer가 계속 반응에 참여하면서 양쪽 strand가 반복적으로 증폭되기 때문에 dsDNA가 빠르게 증가합니다.

Asymmetric RPA는 primer 농도를 동일하게 사용하지 않습니다.

한쪽 primer는 상대적으로 많은 양을 넣고 다른 primer는 제한된 양만 사용합니다.

초기에는 두 primer가 모두 존재하기 때문에 일반적인 RPA와 비슷하게 dsDNA amplification이 진행됩니다.

하지만 낮은 농도로 넣은 primer가 점차 소모되면 상황이 달라집니다.

과량으로 존재하는 primer는 계속 사용할 수 있지만 반대쪽 primer는 부족하기 때문에 양방향의 exponential amplification을 지속하기 어렵습니다.

그 결과 시간이 지나면서 한쪽 strand에 해당하는 ssDNA가 상대적으로 많이 생성되는 asymmetric amplification이 나타납니다.

연구진은 바로 이 ssDNA를 Cas12a의 표적으로 이용했습니다.

Asy-RPA가 PAM 문제를 해결하는 원리

일반적인 RPA와 Cas12a를 결합한다고 생각해 보겠습니다.

RPA에서 만들어진 dsDNA를 Cas12a가 인식하려면 target 부근에 적절한 PAM sequence가 필요합니다.

PAM이 존재하지 않는다면 같은 crRNA를 사용하더라도 Cas12a의 효율적인 target recognition이 어려울 수 있습니다.

반면 Asy-RPA에서는 증폭 과정에서 많은 양의 ssDNA product가 만들어집니다.

이 ssDNA는 Cas12a가 인식할 때 dsDNA와 같은 PAM 조건을 요구하지 않습니다.

따라서 전체적인 개념은 상당히 단순합니다.

Target DNA

→ Asymmetric RPA

→ 특정 ssDNA Strand 증가

→ crRNA와 Cas12a가 ssDNA 인식

→ Cas12a 활성화

→ ssDNA Reporter Trans-cleavage

→ Signal 발생

즉, Cas12a 자체를 변형하거나 새로운 Cas protein을 개발한 것이 아니라 Cas12a에 들어가는 amplification product의 형태를 dsDNA에서 ssDNA 중심으로 바꾼 것입니다.

Sym-RPA와 Asy-RPA의 차이를 비교하다

논문에서 중요한 실험 가운데 하나는 symmetric RPA와 asymmetric RPA를 비교한 부분입니다.

PAM sequence가 존재하는 dsDNA라면 일반적인 Cas12a 반응에서도 target recognition이 가능합니다.

하지만 PAM이 없는 target에서는 symmetric RPA를 이용해 dsDNA를 만들어도 Cas12a activation이 제한됩니다.

연구진은 Asy-RPA를 적용했을 때 이러한 결과가 달라지는지 확인했습니다.

Asy-RPA를 통해 ssDNA product를 충분히 생성하면 PAM이 있는 표적뿐 아니라 PAM이 없는 표적에서도 Cas12a fluorescence signal을 얻을 수 있었습니다.

반면 PAM이 없는 조건에서 일반적인 symmetric RPA product를 이용하면 동일한 방식의 Cas12a activation을 얻기 어렵습니다.

이 비교는 단순히 Asy-RPA가 핵산을 잘 증폭한다는 것을 보여주기 위한 실험이 아닙니다.

PAM-independent Cas12a detection이 Asy-RPA에서 생성된 ssDNA와 관련되어 있다는 것을 보여주는 핵심적인 비교 실험입니다.

Cas12a가 ssDNA를 인식하면 어떤 일이 일어날까?

Asy-RPA에서 생성된 ssDNA 가운데 crRNA와 상보적인 sequence가 존재하면 Cas12a-crRNA complex가 이를 인식할 수 있습니다.

표적 ssDNA가 Cas12a에 의해 인식되면 Cas12a의 trans-cleavage activity가 활성화됩니다.

반응액에는 별도로 fluorescence reporter가 들어 있습니다.

이 reporter는 일반적으로 fluorophore와 quencher가 연결된 짧은 ssDNA로 구성할 수 있습니다.

Reporter가 절단되지 않은 상태에서는 quencher 때문에 fluorescence가 억제됩니다.

Cas12a가 활성화되면 주변의 ssDNA reporter를 비특이적으로 절단합니다.

그 결과 fluorophore와 quencher가 서로 떨어지면서 fluorescence signal이 증가합니다.

따라서,

Asy-RPA에서 생성된 ssDNA 양

→ Cas12a Target Recognition

→ Trans-cleavage

→ Reporter 절단

→ Fluorescence 증가

로 표적 DNA의 존재를 확인할 수 있습니다.

PAM 없이 Mutant Type과 Wild Type을 구별하다

이번 논문에서 흥미로운 부분은 PAM-independent detection에서 한 단계 더 나아가 mutation discrimination에도 기술을 적용했다는 것입니다.

연구진은 Mycobacterium tuberculosis에서 wild-type sequence와 rifampin resistance와 관련된 mutant sequence를 대상으로 실험했습니다.

Asy-RPA를 통해 표적 부위를 ssDNA 형태로 증폭하면 crRNA가 해당 single-stranded sequence를 직접 인식할 수 있습니다.

이때 crRNA와 target 사이에 mutation이 존재하면 Cas12a activation 정도가 달라질 수 있습니다.

연구진은 이러한 Cas12a의 ssDNA sequence discrimination 특성을 이용해 wild-type TB와 rifampin-resistant mutant-type TB를 구별하는 방법으로 확장했습니다.

따라서 이 기술에서 Asy-RPA는 단순히 PAM을 제거하는 보조적인 amplification 방법만은 아닙니다.

Cas12a가 mutation이 위치한 ssDNA를 직접 평가할 수 있도록 target 형태를 만들어준다는 의미도 있습니다.

Asymmetric RPA에도 단점은 있다

Asy-RPA가 PAM 문제를 해결한다고 해서 amplification efficiency까지 항상 symmetric RPA보다 좋은 것은 아닙니다.

오히려 증폭 원리를 생각하면 반대일 수 있습니다.

Symmetric RPA에서는 forward primer와 reverse primer가 지속적으로 반응에 참여하기 때문에 exponential amplification을 효율적으로 유지할 수 있습니다.

반면 Asy-RPA에서는 한쪽 primer의 농도를 의도적으로 낮춥니다.

초기에는 두 primer가 존재하므로 양방향 amplification이 진행될 수 있지만 제한적으로 넣은 primer가 소모되면 한쪽 primer를 중심으로 반응하게 됩니다.

그 이후에는 ssDNA 생성이 증가하는 대신 amplification이 상대적으로 linear한 성격을 나타내게 됩니다.

따라서 Asy-RPA의 목적은 단순히 가장 많은 DNA를 만들어내는 것이 아닙니다.

Cas12a가 PAM 없이 인식할 수 있는 ssDNA를 충분히 생성하는 것이 더 중요한 목적입니다.

즉, amplification efficiency 일부를 포기하면서 target accessibility와 assay design의 자유도를 확보하는 trade-off가 존재한다고 볼 수 있습니다.

왜 일반 RPA 대신 Asy-RPA를 선택했을까?

이 논문을 이해할 때 중요한 질문은 이것입니다.

단순히 RPA를 사용하면 더 효율적인 exponential amplification이 가능한데 왜 굳이 primer 농도를 불균형하게 만들어 Asy-RPA를 사용했을까요?

그 이유는 최종 검출 기술이 CRISPR-Cas12a이기 때문입니다.

일반 RPA에서 많은 dsDNA를 생성하더라도 검출하려는 target 주변에 Cas12a가 사용할 수 있는 PAM이 없다면 crRNA 설계가 제한됩니다.

반대로 Asy-RPA에서는 amplification efficiency가 일부 감소하더라도 PAM이 필요하지 않은 ssDNA를 다량 확보할 수 있습니다.

따라서 이 연구에서는

증폭량을 최대화하는 것보다

Cas12a가 자유롭게 인식할 수 있는 형태의 증폭산물을 만드는 것

이 더 중요했습니다.

Asymmetric amplification을 Cas12a의 생화학적 특성에 맞춰 이용했다는 점이 이 논문의 핵심적인 설계라고 볼 수 있습니다.

전체 검출 원리를 정리하면

이번 논문의 검출 기술은 복잡한 새로운 enzyme reaction을 추가한 방식은 아닙니다.

기존 RPA에서 primer concentration ratio를 변화시키는 것이 중요한 출발점입니다.

전체 과정을 정리하면 다음과 같습니다.

Target DNA

→ 서로 다른 농도의 Forward·Reverse Primer 사용

→ Asymmetric RPA

→ 초기 dsDNA 증폭

→ 제한 Primer 소모

→ 특정 ssDNA Product 축적

→ Cas12a-crRNA의 ssDNA 인식

→ PAM-independent Cas12a Activation

→ Trans-cleavage

→ Fluorescent Reporter 절단

→ Signal 검출

이러한 원리를 이용하면 기존 Cas12a-dsDNA detection에서 문제가 될 수 있는 PAM requirement를 우회할 수 있습니다.

연구진은 이를 LSDV nucleic acid detection에 적용했으며, 나아가 Mycobacterium tuberculosis의 wild type과 rifampin-resistant mutant type을 구별하는 실험까지 진행했습니다.

이 논문에서 주목할 부분

이번 연구에서 가장 흥미로운 점은 CRISPR-Cas12a의 PAM limitation을 해결하기 위해 Cas12a 자체를 바꾼 것이 아니라 그 앞단의 핵산 증폭 방법을 바꿨다는 것입니다.

Cas12a가 dsDNA를 인식할 때는 PAM이 중요한 조건이 되지만 ssDNA recognition에서는 이러한 제한을 동일하게 적용받지 않습니다.

연구진은 여기에 착안해 RPA의 두 primer 농도를 다르게 조절하고 ssDNA가 축적되도록 만들었습니다.

즉,

Cas12a에 맞춰 target sequence를 바꾸는 것이 아니라

amplification product를 Cas12a가 인식하기 좋은 형태로 바꾼 것입니다.

또한 이 기술을 단순한 pathogen positive/negative detection에서 끝내지 않고 sequence가 유사한 target이나 drug-resistance mutation을 구별하는 방식으로 확장했다는 점도 중요합니다.

반면 Asy-RPA는 symmetric RPA와 비교하면 한쪽 primer가 소모된 이후 amplification efficiency가 떨어질 수 있다는 한계도 있습니다.

따라서 이 연구는 Asy-RPA가 기존 RPA보다 무조건 우수하다는 것을 보여주기보다는 RPA의 amplification 방식을 조절하면 CRISPR-Cas12a의 PAM dependency라는 별개의 문제를 해결할 수 있다는 설계적 가능성을 보여준 연구라고 보는 것이 적절합니다.

논문 리뷰를 마치며

이번 논문에서는 asymmetric RPA와 CRISPR-Cas12a를 결합해 PAM sequence에 대한 의존성을 낮춘 핵산 검출 방법을 살펴봤습니다.

일반적인 RPA-Cas12a assay에서는 RPA로 만들어진 dsDNA를 Cas12a가 인식하기 때문에 적절한 PAM이 필요할 수 있습니다.

하지만 primer concentration을 불균형하게 조절한 Asy-RPA를 사용하면 ssDNA product를 증가시킬 수 있고, 이를 이용하면 Cas12a가 PAM에 의존하지 않고 표적을 인식할 수 있습니다.

특히 LSDV를 이용한 PAM-independent nucleic acid detection과 Mycobacterium tuberculosis의 wild type 및 rifampin-resistant mutant type 구별까지 하나의 원리로 연결했다는 점이 흥미롭습니다.

Asy-RPA에서는 amplification efficiency와 ssDNA production 사이의 trade-off를 고려해야 하지만, 기존 증폭 기술의 조건을 조금 다르게 설계해 CRISPR-Cas system 자체가 가지고 있던 제약을 해결했다는 점에서 의미 있는 분자진단 연구라고 볼 수 있습니다.

※ 이 글은 Asymmetric RPA와 CRISPR-Cas12a를 이용한 핵산 검출 연구의 원리를 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다.