Primer 비대칭 증폭으로 구현한 PAM-Free CRISPR-Cas12 검출 기술

CRISPR-Cas12는 핵산 검출에 유용하지만 dsDNA를 인식할 때 PAM 서열의 제약을 받습니다. 이번 글에서는 asymmetric RPA로 ssDNA를 생성해 PAM 의존성을 줄인 검출 기술을 살펴보겠습니다.

Cas12 기반 진단에서 PAM이 문제가 되는 이유

CRISPR-Cas12 system은 표적 DNA를 인식한 이후 주변의 single-stranded DNA를 비특이적으로 절단하는 collateral cleavage 또는 trans-cleavage activity를 나타냅니다.

이러한 특징 때문에 Cas12는 분자진단 기술의 signal amplification 방법으로 활발하게 활용되고 있습니다.

하지만 낮은 농도의 표적 핵산을 Cas12만으로 검출하는 데는 한계가 있을 수 있기 때문에 앞단에 nucleic acid amplification을 결합하는 경우가 많습니다.

대표적으로 Polymerase Chain Reaction(PCR), Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP), Recombinase Polymerase Amplification(RPA) 등이 사용될 수 있습니다.

이들 증폭 기술은 기본적으로 double-stranded DNA product를 생성할 수 있기 때문에 Cas12의 dsDNA recognition과 연결하기에 적합합니다.

문제는 Cas12가 double-stranded DNA를 인식할 때입니다.

Cas12가 dsDNA에 결합하려면 표적 sequence 부근에 해당 Cas12가 인식할 수 있는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)​이 필요합니다.

따라서 검출하고 싶은 위치 주변에 적절한 PAM이 존재하지 않으면 crRNA 설계 범위가 제한될 수 있습니다.

특정 mutation이나 짧은 표적 영역을 정확하게 구별해야 하는 진단 기술에서는 이러한 조건이 더 큰 제약이 될 수 있습니다.

Single-Stranded DNA에서는 다른 접근이 가능하다

연구진이 주목한 것은 Cas12의 single-stranded DNA recognition입니다.

Cas12가 dsDNA를 표적으로 인식할 때는 PAM이 중요하지만, ssDNA를 인식하는 경우에는 동일한 형태의 PAM requirement가 필요하지 않습니다.

따라서 검출 대상 sequence 주변에 PAM이 없더라도 표적을 single-stranded DNA 형태로 충분히 증폭할 수 있다면 Cas12를 이용한 검출이 가능해질 수 있습니다.

하지만 여기에도 문제가 있습니다.

일반적인 PCR, LAMP, symmetric RPA는 주로 dsDNA amplification product를 만들어냅니다.

즉,

Cas12는 ssDNA라면 PAM 없이 인식할 수 있지만

효율적인 핵산 증폭법은 주로 dsDNA를 생성한다

는 두 기술 사이의 차이가 존재합니다.

이번 논문에서는 이 문제를 해결하기 위해 Asymmetric RPA를 이용했습니다.

기존 RPA와 CRISPR-Cas12 결합에서 제시된 문제

저자들은 논문의 서론에서 CRISPR-Cas diagnostic system이 일반적으로 두 단계로 구성된다는 점도 지적합니다.

첫 번째 단계에서는 표적 DNA를 증폭합니다.

두 번째 단계에서는 증폭산물을 Cas12-crRNA complex가 인식하고 reporter를 절단합니다.

즉,

Nucleic Acid Amplification

→ CRISPR-Cas Detection

과정으로 나뉩니다.

이렇게 반응이 분리되어 있으면 첫 번째 반응물을 두 번째 반응으로 옮기는 과정이 필요할 수 있습니다.

실험 단계가 늘어나고 반응 용기를 개방하는 과정에서 amplification product에 의한 contamination 가능성도 고려해야 합니다.

이 때문에 RPA와 CRISPR-Cas12를 하나의 반응 안에서 동시에 진행하는 방법도 연구되어 왔습니다.

하지만 저자들은 이러한 one-pot 형태의 반응에서 amplification efficiency가 충분하지 않을 수 있다는 문제를 제시합니다.

그 원인 가운데 하나로 RPA가 생성한 PAM-containing dsDNA를 Cas12-crRNA가 빠르게 인식하고 절단하면서 증폭반응 자체와 경쟁할 가능성을 제시했습니다.

즉, DNA를 만들어야 하는 RPA와 DNA를 인식하고 절단하는 Cas12가 같은 반응 안에서 서로 간섭할 수 있다는 것입니다.

Asymmetric RPA를 해결책으로 선택하다

연구진은 이 문제를 해결하기 위해 asymmetric amplification에 주목했습니다.

일반적인 symmetric RPA에서는 forward primer와 reverse primer를 비슷한 농도로 넣습니다.

양쪽 primer가 지속적으로 반응하면서 target DNA가 exponential하게 증가하고 주요 산물은 dsDNA가 됩니다.

Asymmetric RPA에서는 두 primer의 농도를 의도적으로 다르게 설정합니다.

한쪽 primer는 많은 양을 사용하고 반대쪽 primer는 매우 적게 넣습니다.

반응 초기에는 두 primer가 모두 존재하기 때문에 일반적인 symmetric RPA와 유사하게 dsDNA가 생성됩니다.

하지만 낮은 농도로 넣은 primer가 점차 소모되면 상황이 달라집니다.

과량으로 존재하는 primer는 계속 DNA synthesis를 시작할 수 있지만 반대쪽 primer는 부족하기 때문에 양방향 amplification이 유지되지 않습니다.

이후에는 특정 방향의 DNA strand가 상대적으로 많이 생성되면서 ssDNA product가 축적됩니다.

연구진은 바로 이 ssDNA를 CRISPR-Cas12의 표적으로 활용했습니다.

반응 초반에는 Symmetric RPA가 진행된다

논문의 모식도를 보면 검출반응은 처음부터 완전히 single-strand amplification으로 진행되는 것이 아닙니다.

먼저 double-stranded target DNA를 forward primer와 reverse primer가 인식합니다.

초기에는 두 primer가 모두 존재하기 때문에 일반적인 RPA와 같은 amplification이 진행됩니다.

이 단계에서는 dsDNA product가 만들어집니다.

하지만 두 primer의 농도가 크게 다르게 설정되어 있기 때문에 낮은 농도로 넣은 primer는 일정 시간이 지나면 대부분 소모됩니다.

이 시점부터 amplification 방식이 달라집니다.

제한 Primer가 소모되면 ssDNA가 증가한다

적은 양으로 넣은 primer가 소진된 이후에도 과량으로 첨가된 primer는 충분히 남아 있습니다.

따라서 기존에 생성된 dsDNA를 template로 한쪽 방향의 DNA synthesis가 계속 진행될 수 있습니다.

하지만 반대쪽 primer가 부족하기 때문에 새롭게 생성된 strand 전체가 다시 dsDNA amplification cycle에 참여하지 못합니다.

결과적으로 한쪽 방향의 single-stranded DNA가 상대적으로 많이 축적됩니다.

전체 과정을 단순화하면 다음과 같습니다.

Double-Stranded Target

→ 초기 Symmetric RPA

→ dsDNA 증가

→ Low-Concentration Primer 소모

→ High-Concentration Primer만 지속적으로 작용

→ Asymmetric Amplification

→ ssDNA 축적

이렇게 만들어진 ssDNA가 PAM-free CRISPR-Cas12 detection을 가능하게 하는 핵심 산물입니다.

ssDNA가 Cas12를 PAM 없이 활성화한다

Asymmetric RPA에서 생성된 ssDNA에 crRNA와 상보적인 target sequence가 존재하면 Cas12-crRNA complex가 이를 인식할 수 있습니다.

이때 dsDNA recognition과 동일한 PAM 조건을 요구하지 않는다는 점이 중요합니다.

즉, target 주변에 Cas12에 적합한 PAM sequence가 없더라도 ssDNA 상태에서는 crRNA가 해당 sequence를 인식할 수 있습니다.

표적 ssDNA를 인식한 Cas12가 활성화되면 주변에 존재하는 ssDNA에 대한 collateral cleavage activity가 나타납니다.

검출 시스템에는 이를 확인하기 위한 DNA reporter가 포함됩니다.

Reporter는 매우 짧은 single-stranded DNA이며 한쪽 말단에는 fluorophore, 다른 쪽 말단에는 quencher가 결합되어 있습니다.

Reporter가 온전한 상태에서는 fluorophore와 quencher가 가까워 fluorescence가 억제됩니다.

하지만 활성화된 Cas12가 reporter를 절단하면 두 물질 사이의 거리가 멀어지면서 fluorescence가 증가합니다.

따라서,

Asy-RPA ssDNA

→ Cas12-crRNA Recognition

→ Collateral Cleavage 활성화

→ DNA Reporter 절단

→ Fluorophore와 Quencher 분리

→ Fluorescence 증가

과정을 통해 표적 핵산을 검출할 수 있습니다.

Primer Ratio가 Asy-RPA의 핵심 조건이다

Asymmetric amplification에서 중요한 요소 가운데 하나는 두 primer 사이의 농도 비율입니다.

두 primer 농도가 비슷하면 일반적인 symmetric RPA처럼 dsDNA가 주로 생성될 가능성이 높습니다.

반대로 두 primer 사이의 농도 차이가 충분히 커지면 제한적으로 넣은 primer가 먼저 소모되고 ssDNA가 축적될 수 있습니다.

연구진은 이를 확인하기 위해 다양한 primer ratio를 실험했습니다.

가장 기본적인 1:1 조건부터 최대 320:1 조건까지 primer concentration ratio를 변화시키면서 amplification product를 비교했습니다.

논문의 agarose gel 결과에서도 primer ratio에 따른 차이를 확인할 수 있습니다.

1:1과 10:1에서는 ssDNA 생성이 뚜렷하지 않았다

Primer ratio가 1:1인 조건에서는 두 primer가 거의 동일하게 반응에 참여합니다.

따라서 일반적인 symmetric RPA가 활발하게 진행되며 dsDNA가 주된 amplification product가 됩니다.

농도 차이를 10:1 정도로 높였을 때도 연구진이 원하는 수준의 ssDNA band는 뚜렷하게 나타나지 않았습니다.

즉, 단순히 두 primer 농도를 조금 다르게 설정한다고 해서 충분한 asymmetric amplification이 만들어지는 것은 아니었습니다.

Primer concentration difference가 더 커질 필요가 있었습니다.

160:1과 320:1에서 ssDNA가 뚜렷하게 증가했다

Primer ratio를 더욱 크게 증가시키자 결과가 달라졌습니다.

논문의 조건 가운데 160:1과 320:1처럼 두 primer의 농도 차이가 큰 조건에서는 ssDNA에 해당하는 amplification product가 보다 분명하게 확인됐습니다.

이는 제한 primer가 상대적으로 빠르게 소진되고 이후 과량의 primer를 이용한 asymmetric amplification이 우세해졌기 때문으로 해석할 수 있습니다.

연구진은 agarose gel electrophoresis뿐 아니라 추가 실험을 통해 primer ratio 증가에 따른 ssDNA 생성도 확인했습니다.

참고로 agarose gel electrophoresis는 DNA가 인산 골격 때문에 가지는 음전하 특성을 이용해 전기장에서 이동시키고 크기 등에 따라 분리하는 방법입니다.

따라서 원문의 표현처럼 DNA의 ‘전기화학적 특성’이라기보다 전하를 이용한 전기영동 분석이라고 설명하는 것이 더 정확합니다.

왜 ssDNA의 양이 중요할까?

이번 연구에서 ssDNA는 단순한 부산물이 아닙니다.

Asymmetric RPA에서 생성되는 ssDNA 자체가 Cas12를 활성화하는 target 역할을 합니다.

따라서 ssDNA 생산량이 부족하면 Cas12 activation 역시 충분하게 일어나지 않을 수 있습니다.

반대로 primer ratio를 적절하게 조절해 ssDNA를 충분히 생산하면 PAM이 없는 target sequence에서도 Cas12를 효과적으로 활성화할 수 있습니다.

결국 primer ratio optimization은 단순한 amplification yield 조절 실험이 아니라 PAM-free Cas12 detection의 성능을 직접 결정하는 과정이라고 볼 수 있습니다.

PAM-Free 반응은 기존 방식과 무엇이 다를까?

일반적인 RPA-Cas12 detection은 다음과 같은 구조를 가질 수 있습니다.

Target dsDNA

→ RPA

→ PAM-containing dsDNA

→ Cas12 Recognition

→ Reporter Cleavage

반면 이번 연구의 Asy-RPA 방식은 다음과 같습니다.

Target dsDNA

→ 초기 RPA

→ Asymmetric Amplification

→ ssDNA 축적

→ PAM-independent Cas12 Recognition

→ Reporter Cleavage

차이는 Cas12가 최종적으로 인식하는 amplification product의 형태입니다.

기존 방식에서는 주로 dsDNA를 인식하지만 이번 방식에서는 Asy-RPA가 만들어낸 ssDNA를 적극적으로 활용합니다.

따라서 검출하려는 sequence 가까이에 적절한 PAM이 존재하지 않아도 crRNA를 설계할 수 있는 범위가 넓어질 수 있습니다.

One-Pot Reaction에도 의미가 있다

이 기술에서 또 하나 중요한 부분은 amplification과 CRISPR detection을 단순히 별개의 과정으로만 생각하지 않았다는 점입니다.

기존의 two-step assay에서는 amplification을 먼저 진행하고 그 산물을 별도의 Cas12 reaction으로 옮길 수 있습니다.

하지만 이러한 방법은 reaction step이 증가합니다.

반면 하나의 reaction system에서 RPA amplification과 Cas12 detection을 함께 수행할 수 있다면 전체 assay를 단순화할 가능성이 있습니다.

문제는 앞서 설명한 것처럼 dsDNA를 활발하게 생성하는 RPA와 이를 인식해 절단하는 Cas12가 동시에 작동하면서 서로 영향을 줄 수 있다는 것입니다.

Asymmetric RPA는 이 문제에 대해서도 다른 접근을 제시합니다.

초기에 일정량의 dsDNA를 만든 뒤 ssDNA 생산을 증가시키고, 이 ssDNA를 이용해 Cas12를 활성화함으로써 RPA의 exponential amplification과 Cas12 cleavage가 직접적으로 충돌하는 정도를 줄이는 방식으로 볼 수 있습니다.

Cas12와 crRNA 조건도 함께 최적화한다

Primer ratio만 결정한다고 전체 assay가 완성되는 것은 아닙니다.

Asy-RPA에서 생성된 ssDNA를 효과적으로 검출하려면 CRISPR-Cas12 reaction 조건도 맞춰야 합니다.

연구진은 Cas12 system과 crRNA concentration을 변화시키며 fluorescence response를 비교했습니다.

Cas12 또는 crRNA가 부족하면 생성된 ssDNA target을 충분히 인식하기 어렵습니다.

반대로 단순히 농도를 계속 높이는 것이 항상 효율적인 것도 아니기 때문에 전체 reaction balance를 고려해야 합니다.

따라서 primer ratio뿐 아니라 Cas12 concentration과 crRNA concentration 역시 중요한 optimization factor가 됩니다.

반응 온도 역시 전체 시스템에 영향을 준다

이번 assay에서는 RPA와 Cas12 reaction을 함께 고려해야 하기 때문에 reaction temperature도 중요한 변수입니다.

RPA enzyme이 활발하게 작동할 수 있는 조건과 Cas12의 cleavage activity가 충분하게 나타나는 조건을 동시에 고려해야 합니다.

한쪽 enzyme만 최적화된 온도를 선택하면 다른 반응의 효율이 떨어질 수 있습니다.

연구진은 이러한 점을 고려해 reaction temperature를 조정하고 전체 fluorescence signal이 효과적으로 발생하는 조건을 확인했습니다.

이는 서로 다른 enzyme system을 하나의 assay로 연결할 때 자주 나타나는 문제입니다.

각 반응의 개별 최고 조건이 아니라 전체 검출 시스템이 가장 효율적으로 작동하는 조건을 찾는 것이 중요합니다.

최종적으로 8분 이내 검출을 구현하다

연구진은 primer ratio, Cas12 조건, crRNA concentration 및 reaction temperature 등 다양한 요소를 최적화했습니다.

그 결과 논문에서는 약 8분 이내에 60 copies/μL 수준의 표적 핵산을 검출할 수 있는 성능을 제시했습니다.

이 결과에서 중요한 것은 단순히 검출시간이나 검출농도만이 아닙니다.

기존 Cas12 dsDNA detection의 PAM requirement를 우회하면서도 RPA 기반 nucleic acid amplification과 연결할 수 있었다는 점입니다.

즉, Cas12 자체를 engineering한 것이 아니라 증폭산물의 형태를 바꾸는 방식으로 CRISPR-Cas12의 설계 제한을 줄인 것입니다.

이 기술에서 Asymmetric RPA가 담당하는 역할

이번 논문을 단순히 RPA의 변형 기술로 보면 핵심을 놓칠 수 있습니다.

Asymmetric RPA의 목적은 일반 RPA보다 더 많은 DNA를 만드는 것이 아닙니다.

오히려 symmetric RPA만 놓고 보면 두 primer를 충분하게 사용해 exponential amplification을 계속 유지하는 것이 DNA 생산량 측면에서는 더 유리할 수 있습니다.

Asy-RPA는 일부 amplification efficiency를 포기하면서 Cas12가 PAM 없이 인식할 수 있는 ssDNA를 만드는 역할을 담당합니다.

따라서 이 연구에서 중요한 것은

더 많은 amplification

이 아니라

검출 시스템에 적합한 형태의 amplification product 생성

이라고 볼 수 있습니다.

이러한 관점에서 보면 primer ratio를 160:1이나 320:1까지 조절한 실험의 의미도 명확해집니다.

단순한 primer optimization이 아니라 Cas12가 사용할 수 있는 ssDNA를 충분하게 확보하기 위한 설계입니다.

전체 반응 원리를 정리하면

이번 논문의 PAM-free detection 원리는 다음과 같이 정리할 수 있습니다.

Double-Stranded Target DNA

→ 비대칭 농도의 RPA Primer 결합

→ 초기 Symmetric RPA

→ dsDNA 생성

→ Low-Concentration Primer 소모

→ Asymmetric RPA 우세

→ Single-Stranded DNA 축적

→ Cas12-crRNA의 ssDNA Recognition

→ PAM Requirement 우회

→ Cas12 Collateral Cleavage

→ Fluorophore-Quencher Reporter 절단

→ Fluorescence Signal 증가

결국 asymmetric RPA는 증폭과 Cas12 recognition 사이를 연결하는 핵심적인 역할을 담당합니다.

논문에서 주목할 부분

이번 연구에서 가장 흥미로운 부분은 PAM 문제를 CRISPR-Cas12 자체의 변형 없이 amplification 단계에서 해결하려고 했다는 점입니다.

기존에는 검출하려는 dsDNA 주변에 적절한 PAM이 존재하는지 확인한 뒤 그 조건에 맞춰 crRNA를 설계해야 했습니다.

이번 방법에서는 RPA product를 ssDNA 형태로 전환해 축적함으로써 이러한 제약을 줄였습니다.

특히 일반적인 RPA reaction을 완전히 새로운 amplification technology로 바꾸지 않고 두 primer 사이의 concentration ratio를 크게 조절하는 것만으로 amplification product의 성격을 변화시킨 것도 흥미로운 부분입니다.

1:1이나 10:1에서는 ssDNA production이 뚜렷하지 않았지만 160:1과 320:1과 같이 큰 농도 차이를 만들었을 때 single-stranded product가 명확하게 증가했다는 실험 결과도 이러한 원리를 뒷받침합니다.

또한 생성된 ssDNA를 Cas12가 인식하면서 PAM-free collateral cleavage를 유도하고 fluorescence reporter까지 연결했습니다.

즉,

Primer Ratio 조절

→ Amplification Product 변화

→ Cas12 Recognition 방식 변화

→ PAM Limitation 완화

라는 설계가 하나로 이어진 연구입니다.

리뷰를 마치며

이번 논문에서는 asymmetric RPA를 이용해 CRISPR-Cas12 기반 핵산 검출에서 발생할 수 있는 PAM requirement를 우회하는 방법을 살펴봤습니다.

일반적인 RPA에서는 forward와 reverse primer가 지속적으로 반응해 dsDNA를 효율적으로 생성합니다.

반면 Asy-RPA에서는 두 primer 농도를 크게 다르게 설정해 초반에는 dsDNA를 증폭하고 이후에는 제한 primer가 소모되면서 ssDNA가 축적되도록 만듭니다.

이렇게 생성된 ssDNA는 Cas12가 dsDNA를 인식할 때 필요한 PAM에 동일하게 의존하지 않기 때문에 보다 자유로운 target recognition에 활용할 수 있습니다.

또한 Cas12가 표적 ssDNA에 의해 활성화되면 collateral cleavage를 통해 fluorophore와 quencher가 부착된 ssDNA reporter를 절단하고 최종적인 fluorescence signal을 발생시킵니다.

특히 Asy-RPA가 단순한 amplification 변형이 아니라 Cas12의 biochemical recognition 특성에 맞춰 amplification product 자체를 설계하는 방법으로 사용됐다는 점이 이 연구의 핵심이라고 볼 수 있습니다.

※ 이 글은 Asymmetric RPA와 CRISPR-Cas12를 이용한 PAM-free 핵산 검출 기술을 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다.