PNA Probe가 단일 염기 돌연변이를 구별하는 원리와 분자진단 활용

DNA에서 단 하나의 염기가 달라지는 변이는 일반적인 probe로 구별하기 어려울 수 있습니다. PNA는 DNA와 다른 인공 backbone을 이용해 높은 결합 안정성을 확보하면서 mismatch에 민감하게 반응하도록 설계할 수 있는 핵산 유사체입니다.

DNA Probe와 구조부터 다른 PNA

분자진단에서는 원하는 DNA나 RNA를 선택적으로 찾기 위해 상보적인 염기서열을 가진 probe를 이용합니다.

일반적인 DNA probe에는 nucleotide를 연결하는 sugar-phosphate backbone이 존재합니다.

Phosphate group 때문에 DNA backbone은 음전하를 띱니다.

반면 PNA(Peptide Nucleic Acid)는 DNA의 sugar-phosphate backbone 대신 반복적인 N-(2-aminoethyl)glycine 기반의 중성 backbone을 갖는 합성 nucleic acid analogue입니다.

Backbone은 DNA와 다르지만 adenine(A), thymine(T), guanine(G), cytosine(C) 등의 nucleobase를 가지고 있기 때문에 상보적인 DNA 또는 RNA sequence를 인식할 수 있습니다.

즉, PNA는 DNA와 구조적으로 동일한 물질은 아니지만 Watson-Crick base pairing을 이용해 특정 핵산 sequence를 인식할 수 있도록 설계할 수 있습니다.

이러한 구조 차이가 PNA의 독특한 hybridization 특성으로 연결됩니다.

중성 Backbone이 결합 특성을 바꾼다

두 DNA strand가 결합할 때는 상보적인 base pairing뿐 아니라 각각의 phosphate backbone이 갖는 음전하도 영향을 줍니다.

동일한 전하를 가진 두 backbone 사이에는 electrostatic repulsion이 존재하기 때문입니다.

PNA backbone은 전기적으로 중성이므로 PNA-DNA duplex에서는 DNA-DNA duplex에서 나타나는 동일한 형태의 backbone 간 electrostatic repulsion이 감소합니다.

그 결과 적절하게 설계된 PNA는 상보적인 DNA나 RNA와 높은 안정성의 duplex를 형성할 수 있습니다.

PNA probe가 분자진단에서 관심을 받는 이유는 단순히 target에 강하게 결합하기 때문만은 아닙니다.

정확하게 상보적인 target과 mismatch를 포함한 target 사이의 hybridization stability 차이를 이용할 수 있다는 점도 중요합니다.

단 하나의 염기 차이를 어떻게 구별할까?

암 관련 mutation이나 약제 내성과 관련된 유전자 변이 가운데에는 wild-type sequence와 mutant sequence 사이에 단 하나의 nucleotide 차이만 존재하는 경우가 있습니다.

이러한 single nucleotide variant를 검출할 때는 단순히 target DNA와 probe가 결합하는지만 확인해서는 충분하지 않을 수 있습니다.

예를 들어 probe가 mutant sequence와 정확하게 상보적이도록 설계됐다고 가정하겠습니다.

Mutant DNA에서는 PNA의 모든 recognition base가 target과 정상적으로 pairing할 수 있습니다.

따라서 안정적인 PNA-DNA duplex가 형성됩니다.

반면 wild-type DNA에서는 mutation 위치에 해당하는 한 염기가 PNA와 맞지 않습니다.

이때 single-base mismatch가 만들어집니다.

Mismatch는 duplex의 안정성을 낮출 수 있으며 적절한 sequence와 reaction condition을 설정하면 perfect match와 mismatch 사이의 차이를 이용해 target을 구별할 수 있습니다.

Melting Temperature 차이를 이용할 수 있다

Nucleic acid duplex는 온도가 증가하면 두 strand로 분리됩니다.

Duplex의 절반 정도가 분리되는 특성을 나타내는 온도를 일반적으로 melting temperature(Tm)라고 합니다.

Perfect-match PNA-DNA duplex와 single-base mismatch를 가진 duplex에서는 thermal stability가 달라질 수 있습니다.

이를 이용하면 특정 온도 범위에서 perfect-match target과 PNA는 안정적으로 결합하지만 mismatch target과의 결합은 상대적으로 불안정하도록 조건을 설정할 수 있습니다.

따라서 PNA probe 설계에서는 단순히 sequence가 상보적인지만 보는 것이 아니라 probe 길이, GC content, target 위치, 주변 sequence와 reaction temperature 등을 함께 고려해야 합니다.

이러한 특성 때문에 PNA는 SNP나 point mutation을 구별하는 probe로 연구되어 왔습니다.

PNA Clamp는 조금 다른 방식으로 작동한다

PNA의 높은 binding affinity를 이용하는 대표적인 방법 가운데 하나가 PNA clamping입니다.

여기에서는 PNA가 직접 강한 fluorescence signal을 만드는 것보다 특정 DNA의 amplification을 억제하는 역할을 할 수 있습니다.

예를 들어 시료 안에 wild-type DNA가 매우 많고 mutant DNA가 극소량 존재한다고 가정하겠습니다.

일반적인 PCR을 수행하면 대부분을 차지하는 wild-type DNA가 함께 증폭됩니다.

그러면 소량의 mutant signal을 구별하기 어려워질 수 있습니다.

이때 wild-type sequence와 정확하게 결합하도록 PNA clamp를 설계할 수 있습니다.

Wild-Type 증폭을 선택적으로 억제한다

PNA가 wild-type DNA에 강하게 결합하면 해당 영역에서 PCR primer extension이나 polymerase 진행을 방해하도록 assay를 설계할 수 있습니다.

PNA 자체는 일반적인 DNA primer와 동일하게 polymerase에 의해 연장되는 primer가 아닙니다.

따라서 target에 결합한 PNA를 이용해 특정 template의 amplification을 억제할 수 있습니다.

반면 mutation이 존재하면 PNA와 target 사이에 mismatch가 만들어집니다.

적절한 조건에서는 PNA의 결합 안정성이 감소하면서 mutant template의 amplification은 상대적으로 덜 억제될 수 있습니다.

결과적으로 처음 시료에서는

Wild-Type DNA ≫ Mutant DNA

였더라도 amplification 이후에는 mutant DNA의 상대적인 검출 가능성을 높이는 방향으로 assay를 설계할 수 있습니다.

이를 PNA-mediated PCR clamping이라고 합니다.

PNA는 Target을 증폭하는 물질이 아니다

PNA 기술을 이해할 때 구분해야 할 부분입니다.

PNA 자체가 PCR처럼 target DNA copy number를 증가시키는 것은 아닙니다.

또한 DNA polymerase처럼 새로운 DNA를 합성하는 enzyme도 아닙니다.

PNA의 핵심적인 역할은 sequence recognition과 hybridization control입니다.

따라서 실제 diagnostic assay에서는 PNA를 PCR, fluorescence probe, melting analysis 또는 다른 signal generation system과 결합할 수 있습니다.

PNA가 target sequence 사이의 작은 차이를 선택적으로 인식하고 다른 기술이 이를 amplification이나 measurable signal로 변환하는 방식입니다.

PCR Primer와 PNA Probe의 차이

PCR primer와 PNA probe는 모두 target nucleic acid에 sequence-specifically 결합할 수 있지만 역할은 다릅니다.

PCR primer에는 DNA polymerase가 extension을 시작할 수 있는 3′-OH가 존재합니다.

Primer가 template에 결합하면 polymerase가 이를 연장하면서 새로운 DNA strand를 합성합니다.

반면 일반적인 PNA probe는 DNA polymerase가 사용하는 DNA primer와 동일하게 작동하지 않습니다.

따라서 PNA를 특정 sequence에 강하게 결합시켜 polymerase reaction을 차단하는 방향으로 이용할 수 있습니다.

이 특성이 PNA clamping의 기반이 됩니다.

극소량 Mutation 검출에서 중요한 이유

Liquid biopsy와 같은 연구에서는 정상 세포에서 유래한 많은 cfDNA 가운데 상대적으로 적은 양의 tumor-associated variant를 찾아야 하는 상황이 발생할 수 있습니다.

이때 문제는 mutant DNA 자체가 검출되지 않는 것뿐 아니라 과량의 wild-type DNA가 동시에 amplification되는 것입니다.

따라서 검출 민감도를 높이는 방법에는 두 가지 방향이 존재할 수 있습니다.

하나는 mutant DNA를 더 강하게 amplification하는 것입니다.

다른 하나는 불필요한 wild-type DNA의 amplification을 선택적으로 줄이는 것입니다.

PNA clamping은 후자의 접근에 해당합니다.

즉, target signal을 무조건 더 크게 만드는 것이 아니라 background가 되는 sequence의 amplification을 억제해 상대적인 mutation discrimination을 높이는 전략입니다.

모든 Single-Base Mutation을 쉽게 구별하는 것은 아니다

PNA가 mismatch discrimination에 유리하다고 해서 모든 mutation을 동일한 성능으로 구별할 수 있는 것은 아닙니다.

Mismatch가 발생하는 위치와 염기의 종류, PNA 길이, 주변 sequence, GC composition 등에 따라 duplex stability가 달라질 수 있습니다.

PNA가 지나치게 길거나 결합력이 너무 강하면 single mismatch가 존재하더라도 target에서 충분히 분리되지 않을 가능성이 있습니다.

반대로 probe가 지나치게 짧으면 원하는 target과의 결합 자체가 불안정할 수 있습니다.

따라서 실제 assay에서는 PNA sequence와 길이뿐 아니라 concentration과 hybridization temperature 등을 함께 최적화해야 합니다.

이 때문에 PNA를 이용한 mutation assay에서도 probe design이 중요한 단계가 됩니다.

PNA의 높은 결합력만 강조해서는 안 되는 이유

PNA의 장점을 설명할 때 흔히 ‘DNA보다 강하게 결합한다’는 특징이 강조됩니다.

하지만 분자진단에서는 결합력이 무조건 강하다고 좋은 것은 아닙니다.

진단 assay에서 필요한 것은 target과 강하게 결합하면서도 non-target과는 충분한 차이를 나타내는 것입니다.

Perfect match뿐 아니라 mismatch target까지 지나치게 안정적으로 붙잡으면 오히려 specificity가 감소할 수 있습니다.

따라서 PNA assay의 핵심은 최대한 높은 binding affinity가 아니라 perfect match와 mismatch 사이의 유용한 discrimination window를 확보하는 것입니다.

PNA Probe 검출 원리를 정리하면

PNA를 이용한 single nucleotide discrimination은 크게 두 방향으로 이해할 수 있습니다.

첫 번째는 직접적인 hybridization discrimination입니다.

Target DNA

→ PNA Probe 결합

→ Perfect Match 또는 Mismatch 형성

→ Duplex Stability 차이

→ Target Sequence 구별

두 번째는 PNA clamping을 이용하는 방법입니다.

Wild-Type + Mutant DNA

→ Wild-Type-specific PNA 결합

→ Wild-Type Amplification 억제

→ Mutant Template 상대적 증폭

→ Mutation Signal 검출

두 방식 모두 PNA의 sequence-specific hybridization을 이용하지만 signal을 만드는 과정은 서로 다릅니다.

DNAzyme이나 CRISPR와도 다른 핵산 인식 전략

기존에 살펴본 DNAzyme이나 CRISPR 기반 assay와 비교하면 PNA의 특징을 더 쉽게 이해할 수 있습니다.

DNAzyme은 특정 구조가 형성됐을 때 catalytic reaction을 수행할 수 있습니다.

CRISPR-Cas system은 guide RNA를 이용해 target을 인식하고 Cas protein의 nuclease activity를 signal generation과 연결할 수 있습니다.

PNA에는 이러한 enzymatic catalytic activity가 없습니다.

대신 인공적으로 설계된 중성 backbone과 nucleobase를 이용한 hybridization 자체가 핵심 기능입니다.

따라서 PNA는 새로운 amplification enzyme이라기보다 기존 molecular diagnostic assay에 sequence discrimination 능력을 추가하는 synthetic recognition molecule로 보는 것이 적절합니다.

분자진단에서 PNA가 갖는 의미

PNA는 DNA와 같은 nucleobase recognition을 이용하면서도 자연적인 DNA와는 다른 backbone을 갖습니다.

이러한 구조적 차이 때문에 높은 duplex stability와 mismatch discrimination이라는 독특한 특성을 이용할 수 있습니다.

특히 정상 sequence와 mutant sequence 사이의 차이가 단 하나의 nucleotide에 불과한 상황에서는 이러한 특성이 유용할 수 있습니다.

다만 실제 diagnostic performance는 PNA 자체의 특성만으로 결정되지 않습니다.

어떤 sequence를 target으로 하는지, PNA를 어느 위치에 배치하는지, 어떤 amplification technology와 연결하는지에 따라 결과가 달라집니다.

따라서 PNA는 독립적인 진단법 하나라기보다 여러 molecular diagnostic platforms에서 사용할 수 있는 sequence-selective molecular recognition element라고 볼 수 있습니다.

마치며

이번 글에서는 PNA probe가 single-base mutation을 구별할 수 있는 기본 원리를 살펴봤습니다.

PNA는 일반적인 DNA의 sugar-phosphate backbone 대신 중성의 synthetic backbone을 사용하는 nucleic acid analogue입니다.

Nucleobase를 통해 DNA나 RNA와 sequence-specifically 결합할 수 있으며, perfect match와 single-base mismatch 사이의 duplex stability 차이를 mutation discrimination에 이용할 수 있습니다.

특히 PNA clamping에서는 이러한 특징을 조금 다른 방식으로 활용합니다.

Wild-type sequence에 PNA를 강하게 결합시켜 amplification을 억제하고 mismatch를 가진 mutant DNA는 상대적으로 amplification될 수 있도록 설계합니다.

따라서 PNA 기술의 핵심을 단순히 ‘DNA에 강하게 결합하는 물질’이라고 정리하기보다는,

Synthetic Neutral Backbone

→ Sequence-Specific Hybridization

→ Mismatch Discrimination

→ Selective Amplification Control

이라는 연결로 이해하는 것이 좋습니다.

극소량의 유전자 변이를 검출해야 하는 분자진단에서는 target을 더 많이 증폭하는 것뿐 아니라 정상 sequence의 amplification을 선택적으로 억제하는 것도 하나의 중요한 전략입니다.

PNA는 바로 이러한 관점에서 기존 DNA probe와 다른 방식으로 single nucleotide discrimination을 구현할 수 있는 분자 인식 소재입니다.

※ 본 글은 PNA probe와 PNA clamping의 분자진단 원리를 설명하기 위한 교육 목적의 콘텐츠이며 특정 질환에 대한 임상 진단을 의미하지 않습니다.