MSRE·Cascade LAMP·CRISPR-Cas12a를 결합한 DNA Methylation 검출 기술

DNA methylation은 암과 관련해 연구되는 대표적인 후성유전학적 변화입니다. 이번 연구에서는 HpaII로 methylation 여부를 구별하고 연쇄적인 핵산 증폭과 CRISPR-Cas12a를 연결해 극미량의 methylated DNA를 검출했습니다.

DNA Methylation을 암 바이오마커로 검출하다

DNA methylation은 대표적인 epigenetic modification 가운데 하나입니다.

특히 CpG site의 cytosine에 methyl group이 추가되는 DNA methylation은 유전자 발현 조절을 비롯한 여러 생물학적 과정과 관련되어 있습니다.

암 연구에서도 특정 유전자 영역의 비정상적인 methylation pattern이 관찰되기 때문에 DNA methylation은 암 진단과 예후, 치료 모니터링 등을 위한 biomarker 후보로 연구되고 있습니다.

문제는 실제 시료에서 특정 위치에 methylation이 발생한 DNA를 매우 낮은 농도까지 선택적으로 검출하는 것입니다.

특히 circulating tumor DNA(ctDNA)를 이용한 liquid biopsy에서는 종양에서 유래한 DNA가 정상적인 cell-free DNA와 함께 존재합니다.

따라서 많은 양의 정상 DNA 사이에서 특정 methylation pattern을 가진 극미량의 DNA를 구별할 수 있는 높은 analytical sensitivity와 specificity가 요구됩니다.

이번 논문의 연구진은 이러한 문제를 해결하기 위해 methylation-sensitive restriction endonuclease(MSRE), cascade amplification, CRISPR-Cas12a​를 하나의 검출 시스템으로 연결했습니다.

기존 DNA Methylation 분석에서는 무엇을 이용할까?

DNA methylation을 분석하는 대표적인 방법 가운데 하나가 bisulfite conversion을 이용하는 방식입니다.

Bisulfite treatment를 수행하면 일반적인 unmethylated cytosine은 다른 형태로 변환되는 반면 methylated cytosine은 상대적으로 보존됩니다.

이 차이를 PCR이나 sequencing으로 분석하면 특정 DNA 영역의 methylation 여부를 확인할 수 있습니다.

Sequencing을 이용하면 넓은 영역의 methylation information을 얻을 수 있다는 장점도 있습니다.

하지만 분석 목적에 따라 복잡한 sample preparation과 분석 장비, 데이터 처리 등이 필요할 수 있습니다.

연구진은 이러한 방법과 다른 bisulfite-free methylation detection에 주목했습니다.

여기에서 중요한 역할을 하는 것이 methylation-sensitive restriction endonuclease입니다.

MSRE는 Methylation 여부를 절단 차이로 구별한다

MSRE는 특정 recognition sequence를 인식하면서 해당 위치의 methylation state에 따라 서로 다른 cleavage activity를 나타낼 수 있습니다.

이번 연구에서는 HpaII가 핵심적인 역할을 합니다.

HpaII는 DNA의

5′-CCGG-3′

sequence를 인식하는 restriction endonuclease입니다.

중요한 것은 해당 recognition site의 methylation 상태에 따라 cleavage 여부가 달라진다는 점입니다.

연구진은 이러한 특징을 이용해 methylated DNA와 unmethylated DNA를 증폭반응 이전 단계에서 구별했습니다.

원리는 비교적 명확합니다.

Unmethylated DNA → HpaII에 의해 절단

반면 적절한 위치가 methylation되어 HpaII cleavage가 억제되면,

Methylated DNA → 절단되지 않고 유지

됩니다.

이 차이가 이후의 amplification 여부를 결정합니다.

Unmethylated DNA는 증폭할 수 없도록 만든다

HpaII가 unmethylated target을 절단하면 DNA가 여러 조각으로 나뉩니다.

이번 assay에서는 절단된 DNA fragment가 너무 짧아 이후 설계된 amplification reaction을 정상적으로 시작하지 못하도록 구성했습니다.

따라서 unmethylated target에서는 연쇄적인 amplification이 유도되지 않습니다.

반대로 methylated target은 HpaII digestion을 피하고 intact DNA 상태를 유지할 수 있습니다.

완전한 target DNA가 남아 있기 때문에 다음 단계의 amplification을 시작할 수 있습니다.

즉, HpaII는 직접적인 fluorescence signal을 발생시키는 것이 아니라

Methylation 여부

→ HpaII Cleavage 여부

→ DNA Template 유지 여부

→ Amplification 가능 여부

로 methylation 정보를 변환합니다.

이것이 전체 assay의 첫 번째 specificity control이라고 볼 수 있습니다.

MSRE 방식이 갖는 특징

MSRE를 이용하면 bisulfite conversion 없이도 특정 recognition site의 methylation 여부를 분석할 수 있습니다.

하지만 제한점도 존재합니다.

Restriction enzyme은 자신이 인식할 수 있는 특정 sequence에서만 작동하기 때문입니다.

따라서 모든 CpG methylation site를 하나의 MSRE로 자유롭게 분석할 수 있는 것은 아닙니다.

이번 논문의 연구진은 오히려 이러한 조건에서 하나의 MSRE recognition site만으로 매우 높은 amplification efficiency를 확보하는 방법에 집중했습니다.

논문 제목에 ‘Single Methylation Sensitive Restriction Endonuclease-Based’라는 표현이 들어간 이유도 이와 관련됩니다.

연구진은 하나의 MSRE recognition site를 이용해 methylation 여부를 구별한 뒤 이를 cascade exponential amplification으로 연결했습니다.

단순한 LAMP 한 번으로 끝나는 기술이 아니다

이번 논문을 이해할 때 중요한 부분입니다.

저자들은 이전 연구에서 LAMP를 이용해 특정 위치의 DNA methylation을 분석하는 방법을 연구한 바 있습니다.

LAMP는 일반적으로 여러 primer와 strand-displacing DNA polymerase를 이용해 일정한 온도에서 DNA를 빠르게 증폭합니다.

Amplification 과정에서 stem-loop 구조를 가진 다양한 DNA product가 만들어지는 것이 특징입니다.

하지만 연구진은 기존 방법만으로 single-molecule level의 methylation을 검출하는 데 한계가 있었다고 설명합니다.

이번 연구에서는 이를 해결하기 위해 두 번의 exponential amplification이 연결되는 cascade amplification structure를 설계했습니다.

따라서 이 기술의 핵심을 단순히

HpaII → LAMP → Cas12a

라고만 이해하기보다는,

HpaII를 이용한 methylation discrimination

→ First exponential amplification

→ Second exponential amplification

→ CRISPR-Cas12a detection

으로 이해하는 것이 더 정확합니다.

Methylated DNA만 첫 번째 증폭을 시작한다

먼저 target DNA에 HpaII를 처리합니다.

Unmethylated DNA는 HpaII recognition site에서 절단됩니다.

절단된 DNA는 이후 amplification을 유도하기에 충분한 구조를 유지하지 못합니다.

따라서 후속 amplification이 제대로 시작되지 않습니다.

반면 methylated DNA는 HpaII에 의해 절단되지 않고 intact template로 남습니다.

이 methylated target이 첫 번째 amplification reaction을 시작하는 template 역할을 합니다.

여기에서 methylation이라는 화학적 modification 정보가 amplification 여부라는 훨씬 큰 신호 차이로 변환되기 시작합니다.

첫 번째 증폭에서 Loop 구조를 가진 DNA가 만들어진다

Methylated target에서 amplification이 시작되면 LAMP 원리를 이용한 exponential amplification이 진행됩니다.

LAMP에서는 inner primer와 strand-displacing polymerase의 작용을 통해 self-priming이 가능한 loop structure가 만들어질 수 있습니다.

이러한 구조가 반복적인 DNA synthesis의 template가 되면서 빠른 amplification이 가능합니다.

이번 연구에서 중요한 것은 첫 번째 amplification product가 단순한 최종 검출산물이 아니라는 점입니다.

첫 번째 반응에서 생성된 product가 다음 amplification reaction을 다시 유도할 수 있도록 설계되어 있습니다.

즉, 하나의 methylated target에서 시작된 반응이 첫 번째 단계에서 많은 amplification product를 만들고, 이 product들이 다시 두 번째 exponential amplification의 시작점으로 작동합니다.

Cascade Exponential Amplification으로 신호를 다시 증폭한다

연구진이 single-molecule 수준의 sensitivity를 확보하기 위해 사용한 핵심 전략이 바로 이 부분입니다.

하나의 target에서 하나의 amplification event만 발생하도록 하는 대신 첫 번째 amplification에서 생성된 산물을 이용해 두 번째 exponential amplification을 연쇄적으로 유도했습니다.

따라서 전체 구조는

Methylated Target

→ First Exponential Amplification

→ 다수의 Intermediate Product

→ Second Exponential Amplification

→ 대량의 Final Amplification Product

로 이어집니다.

두 번의 exponential amplification을 연결함으로써 처음에는 극소량에 불과했던 methylated DNA 정보를 훨씬 큰 nucleic acid signal로 변환할 수 있습니다.

논문 제목에서 ‘Cascade Exponential Amplification Assay’라고 표현한 이유가 바로 이러한 구조 때문입니다.

왜 기존 LAMP보다 민감도가 높아질까?

기존 방식에서는 하나의 target molecule이 amplification을 시작하더라도 그 결과가 하나의 amplification system 안에서만 증가합니다.

이번 방식에서는 첫 번째 amplification product가 다시 다음 amplification을 시작하는 trigger 역할을 합니다.

따라서 단순히 reaction time을 늘려 DNA를 더 많이 만드는 것과는 개념적으로 차이가 있습니다.

첫 번째 amplification에서 target 정보를 복제하고

그 결과를 다시

두 번째 amplification의 입력 신호로 사용

하는 구조입니다.

이러한 cascade design 덕분에 연구진은 single amplification-based method보다 높은 analytical sensitivity를 확보할 수 있었습니다.

마지막 단계에서 CRISPR-Cas12a를 연결한다

Cascade amplification으로 충분한 양의 DNA product가 만들어지면 최종적으로 CRISPR-Cas12a system과 연결됩니다.

Cas12a는 crRNA를 이용해 특정 target sequence를 인식할 수 있습니다.

이번 assay에서는 amplification product와 crRNA가 충분히 hybridization할 수 있도록 설계했습니다.

올바른 methylated target에서 유래한 amplification product가 존재하면 crRNA-Cas12a complex가 이를 인식하면서 Cas12a가 활성화됩니다.

활성화된 Cas12a는 target recognition 이후 주변의 single-stranded DNA를 비특이적으로 절단하는 trans-cleavage activity를 나타냅니다.

이 특징을 이용하면 amplification product의 존재를 최종 signal로 변환할 수 있습니다.

ssDNA Reporter가 최종 신호를 만든다

Cas12a reaction에는 별도의 ssDNA reporter를 넣을 수 있습니다.

Reporter에는 signal을 확인할 수 있는 reporter molecule이 결합되어 있습니다.

Methylated target이 존재하면 cascade amplification을 통해 많은 target-specific product가 생성됩니다.

이 product가 Cas12a-crRNA complex를 활성화합니다.

활성화된 Cas12a는 주변의 ssDNA reporter를 연속적으로 절단합니다.

따라서

Methylated DNA

→ HpaII Digestion 회피

→ Cascade Amplification

→ Cas12a Activation

→ ssDNA Reporter Cleavage

→ Signal 증가

로 methylation 정보를 단계적으로 증폭할 수 있습니다.

반대로 unmethylated DNA는 첫 단계에서 HpaII에 의해 절단되기 때문에 이러한 연쇄반응이 제대로 시작되지 않습니다.

Cas12a가 단순히 민감도만 높이는 것은 아니다

이번 기술에서 Cas12a의 역할을 단순한 추가 signal amplification이라고만 설명하면 중요한 부분을 놓칠 수 있습니다.

Nucleic acid amplification에서는 비특이적인 product가 발생할 가능성을 항상 고려해야 합니다.

단순히 DNA가 많이 생성됐다는 사실만으로 signal을 측정하면 원하는 target sequence에서 유래하지 않은 amplification product가 background에 영향을 줄 수도 있습니다.

Cas12a는 crRNA를 통해 특정 sequence를 인식합니다.

따라서 최종 amplification product가 원하는 target sequence를 포함하고 있는지 다시 확인하는 recognition layer를 추가할 수 있습니다.

동시에 target recognition 후 나타나는 trans-cleavage를 이용해 reporter signal도 증폭할 수 있습니다.

즉, Cas12a는 이번 assay에서

Sequence-specific Recognition

과

Reporter Cleavage

를 연결하는 역할을 합니다.

세 단계의 선택성과 증폭이 연결된다

이번 기술은 하나의 반응만으로 methylation을 판단하지 않습니다.

첫 번째 단계에서는 HpaII가 methylation 여부를 구별합니다.

HpaII → Methylation Selection

두 번째 단계에서는 살아남은 methylated DNA가 cascade amplification을 유도합니다.

Cascade Amplification → Nucleic Acid Signal Amplification

마지막 단계에서는 CRISPR-Cas12a가 amplification product의 sequence를 인식하고 reporter를 절단합니다.

CRISPR-Cas12a → Sequence Recognition + Signal Generation

따라서 전체 시스템은

Methylation Recognition

→ Cascade Amplification

→ Sequence-Specific CRISPR Detection

이라는 세 가지 기능을 연속적으로 연결한 구조입니다.

1 aM 수준의 Methylated DNA를 검출하다

이러한 cascade amplification을 통해 연구진은 매우 낮은 농도의 methylated DNA를 검출했습니다.

논문에서 보고한 detection level은 1 aM입니다.

10 μL reaction system을 기준으로 환산하면 약 6개의 DNA molecule에 해당합니다.

즉, 저자들이 논문 제목에서 제시한 것처럼 single-molecule level에 접근하는 검출 성능을 구현했습니다.

또한 많은 양의 unmethylated DNA가 존재하는 조건에서도 0.1%의 methylated DNA를 구별할 수 있음을 보고했습니다.

이는 실제 methylation analysis에서 중요한 의미를 갖습니다.

분석하려는 시료에서는 methylated DNA만 순수하게 존재하는 것이 아니라 훨씬 많은 양의 unmethylated background DNA와 함께 존재할 수 있기 때문입니다.

정상세포와 암세포의 Methylation 차이도 분석하다

연구진은 단순한 synthetic target에서 검출 성능을 확인하는 데 그치지 않았습니다.

개발한 방법을 이용해 normal cell과 cancer cell 사이의 DNA methylation expression difference도 분석했습니다.

이를 통해 제안한 assay가 실제 biological sample에서 methylation 상태 차이를 구별하는 데 적용될 가능성을 확인했습니다.

다만 이를 곧바로 임상 암 진단법이 확립됐다는 의미로 해석해서는 안 됩니다.

이번 연구는 DNA methylation biomarker를 초고감도로 분석할 수 있는 analytical platform을 제시하고 세포 수준에서 적용 가능성을 검증한 연구로 이해하는 것이 적절합니다.

Bisulfite-Free 검출이라는 점도 중요하다

이번 assay에서는 methylation 여부를 확인하기 위해 bisulfite conversion을 사용하지 않습니다.

대신 HpaII라는 methylation-sensitive restriction enzyme의 cleavage 특성을 이용합니다.

따라서 전체 원리는

Chemical Conversion

이 아니라

Enzymatic Discrimination

에 기반합니다.

HpaII가 unmethylated DNA를 선택적으로 절단하고 methylated DNA는 intact 상태로 남기는 차이를 amplification trigger로 변환합니다.

연구진도 이 방법을 bisulfite-free method로 제시했습니다.

물론 HpaII가 인식할 수 있는 sequence가 필요하다는 MSRE 특유의 제한은 존재합니다.

따라서 모든 DNA methylation site를 제한 없이 분석할 수 있다는 의미는 아닙니다.

전체 검출 원리를 정리하면

이번 논문의 DNA methylation 검출 과정을 순서대로 정리하면 다음과 같습니다.

Target DNA

→ HpaII 처리

→ 5′-CCGG-3′ Site의 Methylation 상태 판별

Unmethylated DNA

HpaII Cleavage

→ 짧은 DNA Fragment 생성

→ 후속 Amplification 불가

→ Cas12a Activation 없음

→ 낮은 Signal

Methylated DNA

HpaII Cleavage 회피

→ Intact DNA 유지

→ First Exponential Amplification

→ Intermediate Amplification Products 생성

→ Second Exponential Amplification

→ 대량의 Target-Specific Product

→ crRNA-Cas12a Recognition

→ Cas12a Trans-Cleavage 활성화

→ ssDNA Reporter 절단

→ Signal 발생

이렇게 보면 HpaII, cascade amplification, CRISPR-Cas12a가 각각 서로 다른 기능을 담당하고 있다는 것을 알 수 있습니다.

이번 연구에서 가장 흥미로운 부분

이번 논문에서 주목할 부분은 단순히 LAMP와 CRISPR-Cas12a를 함께 사용했다는 점만은 아닙니다.

첫 번째 핵심은 하나의 MSRE recognition site만 이용해 methylated DNA와 unmethylated DNA를 구별했다는 것입니다.

두 번째는 살아남은 methylated DNA를 하나의 amplification으로 끝내지 않고 두 번의 exponential amplification이 연결되는 cascade structure로 확장했다는 점입니다.

마지막으로 amplification product를 CRISPR-Cas12a가 다시 sequence-specifically 인식하도록 만들었습니다.

따라서,

HpaII의 Methylation Selectivity

Cascade Amplification의 높은 Sensitivity

CRISPR-Cas12a의 Sequence Recognition과 Trans-Cleavage

를 하나의 assay 안에 결합한 것입니다.

이러한 설계를 통해 연구진은 1 aM 수준의 methylated DNA를 검출하고 0.1% methylation abundance까지 구별할 수 있었습니다.

논문 리뷰를 마치며

이번 연구에서는 methylation-sensitive restriction endonuclease와 cascade exponential amplification, CRISPR-Cas12a를 결합한 DNA methylation 검출 방법을 살펴봤습니다.

가장 먼저 HpaII가 5′-CCGG-3′ recognition site의 methylation 상태를 구별합니다.

Unmethylated DNA는 절단되어 후속 amplification을 제대로 유도하지 못하지만 methylated DNA는 intact 상태로 남아 amplification template가 됩니다.

이후 연구진은 단일 amplification에 의존하지 않고 두 exponential amplification reaction을 cascade 형태로 연결해 극소량의 methylated DNA 정보를 크게 증폭했습니다.

마지막에는 생성된 amplification product를 crRNA-Cas12a system이 인식하고 trans-cleavage를 활성화해 최종 reporter signal로 변환합니다.

그 결과 연구진은 1 aM, 즉 10 μL에서 약 6 molecules에 해당하는 methylated DNA를 검출했으며, 다량의 unmethylated DNA 속에서 0.1% methylated DNA도 구별​했습니다.

결국 이 연구의 핵심은 DNA methylation을 단순히 증폭해 측정한 것이 아니라,

MSRE를 이용한 Methylation Discrimination

→ Cascade Exponential Amplification

→ CRISPR-Cas12a Recognition

이라는 서로 다른 원리를 단계적으로 연결해 single-molecule 수준의 검출 성능을 확보했다는 점에 있습니다.

※ 이 글은 Pataer, Zhang, Li의 Analytical Chemistry 96(32), 13335–13343 (2024), DOI 10.1021/acs.analchem.4c03638에 보고된 DNA methylation 검출 기술을 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다.