Hybridization Chain Reaction의 원리와 miRNA 검출 기술

Hybridization Chain Reaction은 효소 없이 DNA hairpin의 연쇄적인 구조 변화를 이용해 신호를 증폭하는 기술입니다. 짧은 initiator가 첫 hairpin을 열면 다음 hairpin이 연속적으로 결합하면서 긴 DNA assembly가 만들어집니다.

DNA Hybridization으로 연쇄반응을 만든다

극소량의 DNA나 RNA를 검출하려면 작은 분자 정보를 측정 가능한 신호로 확대하는 과정이 필요합니다.

PCR이나 LAMP에서는 DNA polymerase가 새로운 핵산을 합성합니다.

하지만 DNA가 가진 상보적인 염기서열과 구조 변화만으로도 signal amplification system을 만들 수 있습니다.

대표적인 방법이 Hybridization Chain Reaction(HCR)입니다.

HCR은 2004년 Dirks와 Pierce가 소개한 enzyme-free nucleic acid amplification 방식으로, 서로 반응할 가능성을 가지고 있지만 평소에는 닫혀 있는 DNA hairpin들을 이용합니다.

특정 initiator가 나타나면 첫 번째 hairpin이 열립니다.

열린 hairpin이 두 번째 hairpin을 열고, 다시 두 번째 hairpin이 새로운 첫 번째 hairpin을 여는 과정이 반복됩니다.

결과적으로 짧은 initiator 하나가 길게 성장한 DNA assembly 형성을 시작할 수 있습니다.

HCR에는 두 종류의 Hairpin이 필요하다

가장 기본적인 HCR은 두 종류의 metastable DNA hairpin으로 설명할 수 있습니다.

각각을

H1

H2

라고 하겠습니다.

H1과 H2는 서로 상보적인 sequence domain을 가지고 있습니다.

하지만 처음부터 두 hairpin이 자유롭게 결합하지는 않습니다.

반응에 필요한 sequence가 각각의 stem 내부에 숨겨져 있기 때문입니다.

따라서 initiator가 없는 상태에서는

H1 = Closed Hairpin

H2 = Closed Hairpin

상태를 유지합니다.

이렇게 kinetic barrier를 만들어 H1과 H2 사이의 spontaneous hybridization을 억제합니다.

Metastable Hairpin이란 무엇일까?

H1과 H2는 서로 결합하면 더 안정적인 구조를 형성할 수 있도록 설계할 수 있습니다.

그런데도 평소에는 각각 hairpin 상태로 존재합니다.

두 hairpin 사이의 반응을 시작할 수 있는 sequence가 stem 구조에 가려져 있기 때문입니다.

즉, 최종적으로 더 안정적인 구조를 만들 가능성은 있지만 반응을 시작하기 위한 pathway가 제한된 상태입니다.

이를 HCR에서는 metastable state로 이해할 수 있습니다.

이 상태를 깨뜨리는 것이 initiator입니다.

Initiator가 H1의 Toehold를 인식한다

H1에는 initiator가 접근할 수 있는 single-stranded toehold 영역이 노출되어 있습니다.

Initiator에는 이 부분과 상보적인 sequence가 존재합니다.

두 sequence가 만나면 먼저 짧은 hybridization이 형성됩니다.

이 결합을 출발점으로 branch migration이 진행되면서 H1의 stem이 풀리기 시작합니다.

즉,

Initiator

→ H1 Toehold Recognition

→ Branch Migration

→ H1 Opening

순서로 첫 번째 구조 변화가 발생합니다.

이 과정은 별도의 polymerase나 nuclease 없이 DNA hybridization에 의해 진행될 수 있습니다.

H1이 열리면 H2를 여는 Sequence가 나타난다

H1이 닫혀 있을 때는 H2와 반응할 수 있는 중요한 sequence가 stem 안에 숨겨져 있습니다.

Initiator가 H1을 열면 이 sequence가 외부로 노출됩니다.

이제 열린 H1은 새로운 initiator처럼 H2를 인식할 수 있습니다.

노출된 H1의 영역이 H2의 toehold에 결합합니다.

다시 branch migration이 진행되고 H2의 stem이 열립니다.

따라서 HCR에서는 하나의 구조 변화가 다음 구조 변화를 유도합니다.

Initiator가 H1을 열고

열린 H1이 H2를 열며

열린 H2가 다시 새로운 H1을 여는

연쇄반응이 만들어집니다.

열린 H2가 다시 새로운 H1을 연다

H2가 열리면 또 다른 sequence domain이 노출됩니다.

이 영역은 아직 반응하지 않은 새로운 H1의 toehold와 상보적으로 설계되어 있습니다.

따라서 열린 H2는 새로운 H1에 결합합니다.

새로운 H1의 stem이 풀리고 H1이 다시 H2를 열 수 있는 구조로 변합니다.

이 반응은 hairpin이 남아 있는 동안 반복될 수 있습니다.

전체 과정을 단순화하면

Initiator

→ H1 Opening

→ H2 Opening

→ 새로운 H1 Opening

→ 새로운 H2 Opening

→ 반복

으로 이어집니다.

이러한 연쇄적인 hybridization 때문에 Hybridization Chain Reaction이라는 이름이 붙었습니다.

최종적으로 긴 DNA Polymer가 만들어진다

HCR이 진행될수록 H1과 H2가 번갈아 연결됩니다.

결과적으로

H1-H2-H1-H2-H1-H2…

형태로 길게 성장한 nucleic acid assembly가 형성됩니다.

이 구조는 하나의 완전히 연속된 covalent double-stranded DNA와는 다릅니다.

각 hairpin molecule은 hybridization을 통해 연결되므로 backbone 사이에 nick이 존재하는 nicked double-stranded polymer 형태로 설명할 수 있습니다.

따라서 HCR에서 증가하는 것은 target DNA의 copy number가 아닙니다.

미리 준비된 H1과 H2가 initiator를 시작점으로 계속 조립되면서 긴 DNA structure가 만들어지는 것입니다.

PCR과 HCR의 증폭 개념은 다르다

PCR에서는 DNA polymerase가 새로운 DNA를 합성합니다.

Cycle이 반복되면서 target-derived DNA molecule의 수가 증가합니다.

HCR에서는 polymerase가 존재하지 않습니다.

H1과 H2 역시 반응이 시작되기 전에 이미 합성되어 있습니다.

Initiator가 하는 일은 이 hairpin들이 서로 결합할 수 있도록 순차적으로 구조를 열어주는 것입니다.

따라서 HCR은

Target Copy Amplification

이라기보다

Target-Triggered Molecular Assembly

를 이용한 signal amplification으로 이해하는 것이 적절합니다.

긴 HCR Product가 어떻게 Signal을 키울까?

HCR product에는 H1과 H2가 반복적으로 존재합니다.

이 반복 구조를 이용하면 하나의 initiator recognition event 주변에 많은 reporter를 모을 수 있습니다.

예를 들어 H1이나 H2 자체에 fluorophore를 결합할 수 있습니다.

HCR이 진행되면 많은 fluorescent hairpin이 하나의 polymer structure에 포함됩니다.

또는 HCR product 내부에 반복적으로 존재하는 sequence를 인식하는 fluorescent probe를 추가할 수도 있습니다.

결과적으로 처음에는 작은 initiator 하나에 불과했던 정보가

긴 HCR Polymer

와

다수의 Fluorescent Reporter

로 변환됩니다.

이것이 HCR 기반 signal amplification의 기본적인 원리입니다.

CHA와 HCR은 무엇이 다를까?

직전 글에서 살펴본 Catalytic Hairpin Assembly와 HCR은 겉으로 보면 매우 비슷합니다.

두 기술 모두 metastable hairpin과 toehold-mediated strand displacement를 사용합니다.

하지만 amplification mechanism에는 중요한 차이가 있습니다.

CHA에서는 target이 H1을 열고 H2 assembly를 유도한 뒤 다시 방출됩니다.

방출된 target이 다른 H1에 다시 반응하면서 여러 개의 H1-H2 complex를 생성합니다.

즉, 핵심은 target recycling과 catalytic turnover입니다.

반면 기본적인 HCR에서는 initiator가 첫 H1을 열면서 chain reaction을 시작합니다.

그 이후에는 열린 H1과 H2가 서로 다음 hairpin을 연속적으로 열면서 하나의 긴 polymer가 성장합니다.

따라서

CHA → Catalytic Target Recycling

HCR → Initiator-Triggered Chain Growth

라는 차이로 구분할 수 있습니다.

HCR에서 Initiator는 반드시 Target 자체일 필요가 없다

가장 단순한 HCR에서는 검출하려는 target nucleic acid 자체를 initiator로 설계할 수 있습니다.

하지만 실제 biosensor에서는 target recognition과 HCR initiation을 분리하기도 합니다.

예를 들어 target이 특정 probe와 결합했을 때만 HCR initiator sequence가 노출되도록 만들 수 있습니다.

평소에는 initiator를 hairpin이나 duplex 안에 숨겨둡니다.

Target이 들어오면 구조가 변하면서 initiator가 노출됩니다.

그러면 노출된 initiator가 H1을 열고 HCR이 시작됩니다.

이러한 방식은

Target Recognition

→ Initiator Exposure

→ HCR

이라는 구조를 만듭니다.

따라서 HCR을 다양한 DNA, RNA, protein recognition system과 연결할 수 있습니다.

miRNA는 HCR의 Initiator가 될 수 있다

HCR은 miRNA detection 연구에도 활용되어 왔습니다.

miRNA는 길이가 짧은 non-coding RNA로 일반적으로 약 18~24 nucleotide 정도의 길이를 가지며 gene regulation에 관여합니다.

특정 miRNA를 HCR initiator로 활용하려면 H1의 노출된 toehold와 해당 miRNA가 상보적으로 결합하도록 sequence를 설계할 수 있습니다.

Target miRNA가 존재하면 H1을 열고 HCR chain reaction이 시작됩니다.

그 결과 처음에는 매우 짧은 RNA molecule 하나였던 정보가 긴 H1-H2 assembly로 변환됩니다.

이 긴 product에 여러 fluorescent reporter를 연결하면 target-dependent signal을 증폭할 수 있습니다.

짧은 miRNA를 검출할 때 생기는 문제

miRNA는 길이가 짧기 때문에 일반적인 긴 DNA target과 동일한 방식으로 probe를 자유롭게 설계하기 어렵습니다.

사용할 수 있는 recognition sequence 자체가 제한적이기 때문입니다.

또한 let-7 family처럼 서로 매우 유사하고 한두 nucleotide 정도만 다른 miRNA도 존재합니다.

따라서 특정 miRNA만 구별하려면 단순히 HCR을 사용한다는 사실만으로 충분하지 않습니다.

Target recognition 영역의 sequence와 길이, mismatch 위치, reaction temperature 등을 정밀하게 설계해야 합니다.

HCR은 signal을 증폭해주는 기술이지 그 자체가 모든 sequence specificity 문제를 해결해주는 것은 아닙니다.

Single-Base Mismatch가 HCR 시작 여부를 바꿀 수 있다

HCR의 specificity는 첫 번째 initiation 단계에서 크게 영향을 받을 수 있습니다.

Target이 H1의 toehold와 정확하게 결합하면 branch migration이 원활하게 진행되고 H1이 열릴 수 있습니다.

반면 target에 mismatch가 존재하면 hybridization stability나 strand displacement kinetics가 감소할 수 있습니다.

특히 mismatch가 initial recognition이나 branch migration에 중요한 위치에 존재하면 HCR initiation efficiency에 차이가 나타날 수 있습니다.

이를 이용하면 perfect-match target에서는 강한 HCR signal이 발생하고 mismatch target에서는 낮은 signal이 나타나도록 assay를 설계할 가능성이 있습니다.

하지만 실제 discrimination 성능은 sequence에 따라 달라지므로 실험적인 optimization이 필요합니다.

Amplified HCR은 더 높은 신호를 만들 수 있다

기본 HCR 외에도 signal amplification을 강화하기 위해 여러 변형 구조가 개발되어 왔습니다.

예를 들어 첫 번째 HCR product가 또 다른 HCR reaction을 시작하도록 설계할 수 있습니다.

또는 branched structure를 만들어 하나의 reaction product에서 여러 개의 새로운 hairpin assembly가 시작되도록 구성할 수도 있습니다.

이렇게 하면 단순한 linear HCR보다 많은 reporter를 축적할 수 있습니다.

하지만 amplification stage를 늘리면 항상 장점만 생기는 것은 아닙니다.

Reaction network가 복잡해질수록 target-independent leakage와 nonspecific assembly 가능성도 증가할 수 있습니다.

따라서 높은 amplification factor와 낮은 background 사이의 균형이 중요합니다.

In Situ HCR은 조금 다른 장점을 가진다

HCR이 특히 많이 연구되는 분야 가운데 하나가 in situ nucleic acid imaging입니다.

세포나 조직 내부의 특정 RNA 위치를 확인할 때 단순한 fluorescent probe 하나만 target에 결합하면 signal이 약할 수 있습니다.

HCR에서는 target recognition probe가 특정 RNA를 찾은 뒤 그 위치에서 HCR initiator가 활성화되도록 설계할 수 있습니다.

그러면 fluorescent H1과 H2가 해당 위치 주변에서 연쇄적으로 조립됩니다.

결과적으로 하나의 RNA recognition event 주변에 많은 fluorophore가 모이게 됩니다.

따라서 target의 위치 정보를 유지하면서 fluorescence signal을 강화할 수 있습니다.

이는 target nucleic acid를 tube 전체에서 증폭하는 방식과 다른 HCR의 중요한 활용 방식입니다.

Spatial Information을 유지할 수 있다는 의미

PCR을 이용해 조직에서 추출한 RNA를 증폭하면 특정 RNA가 존재했다는 사실은 알 수 있지만 원래 어느 세포의 어느 위치에 존재했는지는 잃어버릴 수 있습니다.

In situ HCR에서는 target RNA가 존재하는 위치에서 hairpin assembly가 형성되도록 할 수 있습니다.

따라서 signal amplification이 일어나더라도 원래 target의 spatial information을 보존하는 방향으로 assay를 설계할 수 있습니다.

이러한 특성 때문에 HCR은 단순한 molecular diagnostic assay뿐 아니라 gene expression imaging과 spatial biology 분야에서도 활용됩니다.

HCR의 가장 중요한 문제 중 하나는 Leakage다

HCR에서도 CHA와 마찬가지로 target-independent background reaction을 고려해야 합니다.

이론적으로 H1과 H2는 initiator가 없으면 각각 닫힌 상태를 유지해야 합니다.

하지만 hairpin 설계가 불안정하거나 두 hairpin 사이에 예상하지 않은 상호작용이 발생하면 initiator 없이도 HCR이 일부 진행될 수 있습니다.

이러한 leakage가 누적되면 target이 없는 negative sample에서도 fluorescence가 증가합니다.

특히 매우 낮은 농도의 target을 검출하려면 작은 background signal도 sensitivity를 제한할 수 있습니다.

따라서 HCR 설계에서는 hairpin의 metastability를 안정적으로 유지하는 것이 중요합니다.

Stem을 강하게 만드는 것만으로는 부족하다

Leakage를 막기 위해 H1과 H2의 stem을 매우 안정적으로 설계하면 spontaneous opening을 줄일 수 있습니다.

하지만 stem이 지나치게 안정적이면 initiator가 존재해도 hairpin opening이 느려질 수 있습니다.

즉,

높은 Hairpin Stability

는 background를 줄이는 데 도움이 될 수 있지만

낮은 Reaction Rate

로 이어질 가능성도 있습니다.

반대로 hairpin을 쉽게 열리도록 만들면 target response는 빨라질 수 있지만 leakage가 증가할 수 있습니다.

따라서 HCR 역시

Reaction Speed

Signal Amplification

Background Suppression

사이의 균형이 중요합니다.

Hairpin 농도가 높다고 항상 좋은 것은 아니다

H1과 H2의 concentration을 증가시키면 HCR에 사용할 수 있는 building block이 많아집니다.

따라서 reaction speed나 최종 signal이 증가할 가능성이 있습니다.

하지만 concentration이 지나치게 높으면 H1과 H2 사이의 spontaneous interaction 가능성도 높아질 수 있습니다.

그 결과 target-independent background가 증가할 수 있습니다.

또한 실제 biological sample이나 in situ assay에서는 probe diffusion과 nonspecific binding까지 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 hairpin concentration은 단순히 많이 넣는 것이 아니라 signal-to-background ratio를 기준으로 최적화해야 합니다.

Enzyme-Free가 의미하는 것은 무엇일까?

HCR에서는 polymerase나 nuclease가 필요하지 않습니다.

이 때문에 enzyme-free amplification이라고 부릅니다.

그러나 이것이 HCR이 아무 조건에서나 동일하게 작동한다는 의미는 아닙니다.

DNA hybridization은 temperature, salt concentration, magnesium ion과 sequence composition 등에 영향을 받을 수 있습니다.

Hairpin folding 상태도 이러한 환경에 따라 달라질 수 있습니다.

따라서 enzyme의 catalytic condition을 맞출 필요는 없지만 nucleic acid thermodynamics와 kinetics를 고려한 reaction design은 여전히 필요합니다.

HCR과 RCA는 긴 Product를 만들지만 원리는 다르다

RCA와 HCR 모두 매우 긴 nucleic acid product를 만들 수 있다는 공통점이 있습니다.

하지만 생성 방식은 완전히 다릅니다.

RCA에서는 circular template와 DNA polymerase가 필요합니다.

Polymerase가 원형 template를 반복해서 복제하면서 하나의 긴 ssDNA를 합성합니다.

반면 HCR에서는 새로운 DNA를 합성하지 않습니다.

이미 존재하는 H1과 H2가 번갈아 hybridization하면서 긴 supramolecular assembly를 만듭니다.

따라서

RCA → Enzymatic DNA Synthesis

HCR → Enzyme-Free DNA Assembly

로 구분할 수 있습니다.

HCR 기반 miRNA 검출 과정을 정리하면

Target miRNA를 직접 initiator로 사용하는 가장 단순한 시스템을 가정하면 다음과 같습니다.

Target이 없는 경우

H1 Closed

H2 Closed

→ Chain Reaction 없음

→ Low Signal

Target miRNA가 존재하는 경우

Target miRNA

→ H1 Toehold 결합

→ H1 Opening

→ H2 Recognition Sequence 노출

→ H2 결합 및 Opening

→ 새로운 H1 Recognition Sequence 노출

→ 새로운 H1 Opening

→ H2 Opening 반복

→ H1-H2-H1-H2… Polymer 형성

→ Fluorescent Reporter 축적

→ Signal 증가

즉, 짧은 miRNA의 존재가 긴 DNA assembly로 변환됩니다.

CHA와 HCR을 다시 비교하면

두 기술은 비슷해 보이기 때문에 정확히 구분하는 것이 중요합니다.

CHA에서는 일반적으로 target이

H1 Opening

→ H2 Assembly

를 유도한 뒤 다시 방출됩니다.

따라서 동일한 target이 여러 reaction cycle을 반복할 수 있습니다.

HCR에서는 initiator가 첫 번째 hairpin을 열고 이후 열린 hairpin 자체가 다음 hairpin의 initiator 역할을 합니다.

따라서

Initiator

→ H1

→ H2

→ H1

→ H2

로 chain이 길어집니다.

결국 두 기술의 핵심적인 amplification 방식은

CHA = Target Recycling

HCR = Polymer Chain Growth

로 정리할 수 있습니다.

분자진단에서 HCR이 갖는 의미

HCR은 nucleic acid를 단순한 genetic material이 아니라 programmable molecular building block으로 이용합니다.

H1과 H2에는 처음부터 서로 결합할 수 있는 sequence information이 들어 있습니다.

하지만 hairpin structure가 이를 숨기고 있습니다.

Target 또는 initiator가 들어오면 첫 번째 구조적 barrier가 제거되고 이후 reaction이 연쇄적으로 진행됩니다.

따라서 HCR은

Molecular Recognition

→ Structural Switching

→ Self-Assembly

→ Signal Amplification

을 하나의 DNA reaction network로 구현합니다.

특히 enzyme 없이 작동하면서 target 위치에서 직접 signal을 확대할 수 있다는 특징 때문에 solution-based biosensing뿐 아니라 RNA imaging과 in situ analysis에서도 활용 가치가 있습니다.

마치며

Hybridization Chain Reaction은 두 종류의 metastable DNA hairpin을 이용하는 enzyme-free signal amplification 기술입니다.

Target 또는 별도의 initiator가 H1의 toehold를 인식하면 strand displacement를 통해 H1이 열립니다.

열린 H1은 H2를 열 수 있는 sequence를 노출하고 H2가 결합하면서 다시 다음 H1을 열 수 있는 영역이 나타납니다.

이 과정이 반복되면서

H1-H2-H1-H2-H1-H2…

형태의 긴 nicked double-stranded assembly가 성장합니다.

따라서 전체 원리는

Initiator Recognition

→ H1 Opening

→ H2 Opening

→ Alternating Hairpin Assembly

→ Long HCR Polymer

→ Signal Amplification

으로 정리할 수 있습니다.

HCR의 핵심은 target DNA나 RNA를 효소로 복제하는 것이 아닙니다.

하나의 짧은 initiator가 미리 준비된 DNA hairpin들의 연쇄적인 자기조립을 시작하도록 프로그램했다는 것입니다.

이러한 특징을 이용하면 miRNA와 같은 짧은 핵산을 긴 DNA assembly로 변환해 검출 신호를 높일 수 있으며, target의 위치를 유지해야 하는 in situ nucleic acid imaging에도 응용할 수 있습니다.

다만 높은 sensitivity를 얻으려면 initiator가 없는 상태에서 H1과 H2가 스스로 반응하는 leakage를 억제하면서 target이 존재할 때는 충분히 빠르게 chain reaction이 시작되도록 hairpin 구조와 reaction condition을 정밀하게 설계해야 합니다.

※ 본 글은 Hybridization Chain Reaction과 miRNA 검출 원리를 설명하기 위한 교육 목적의 콘텐츠이며 특정 질환에 대한 임상 진단 성능을 의미하지 않습니다.