Catalytic Hairpin Assembly를 활용한 무효소 핵산 신호 증폭 기술

핵산 신호 증폭에는 반드시 polymerase나 nuclease가 필요한 것은 아닙니다. Catalytic Hairpin Assembly는 서로 분리된 DNA hairpin의 구조 변화를 이용하고, 표적 핵산을 반복적으로 재사용해 검출 신호를 증가시키는 enzyme-free amplification 기술입니다.

효소 없이 핵산 신호를 증폭할 수 있을까?

PCR, LAMP, RPA, RCA와 같은 nucleic acid amplification에서는 enzyme이 핵심적인 역할을 합니다.

DNA polymerase가 새로운 DNA strand를 합성하거나 recombinase, nicking enzyme 등의 작용을 이용해 target-derived product를 증가시킵니다.

이러한 방식은 매우 효과적이지만 enzyme activity를 유지하기 위한 reaction condition과 reagent storage 등을 고려해야 합니다.

이와 전혀 다른 방식으로 signal을 증폭하는 전략도 연구되어 왔습니다.

DNA가 가지고 있는 sequence-specific hybridization과 strand displacement만을 이용하는 것입니다.

대표적인 방법 가운데 하나가 Catalytic Hairpin Assembly, CHA입니다.

CHA에서는 새로운 DNA를 합성하지 않습니다.

대신 미리 준비된 metastable DNA hairpin들이 target을 만났을 때 순차적으로 열리고 서로 결합하도록 설계합니다.

그리고 처음 반응을 시작한 target은 최종 complex에 소비되지 않고 다시 방출될 수 있습니다.

방출된 target이 다른 hairpin에 동일한 반응을 반복하면서 하나의 target molecule이 여러 개의 assembly product 생성을 유도할 수 있습니다.

CHA를 구성하는 두 개의 Hairpin

CHA의 기본적인 시스템은 두 종류의 DNA hairpin으로 설명할 수 있습니다.

편의상 각각을

Hairpin 1(H1)

Hairpin 2(H2)

라고 하겠습니다.

H1과 H2에는 서로 상보적인 sequence가 포함되어 있습니다.

그렇다면 두 DNA를 한 용액에 넣는 순간 바로 결합해야 할 것처럼 보입니다.

하지만 실제 CHA에서는 그렇지 않도록 설계합니다.

각각의 complementary sequence가 hairpin의 stem 내부에 숨겨져 있기 때문입니다.

H1은 자신의 상보적인 영역끼리 결합해 stem-loop structure를 형성합니다.

H2도 마찬가지입니다.

따라서 target이 없는 상태에서는 H1과 H2가 서로 반응할 수 있는 sequence가 충분히 노출되지 않습니다.

이러한 상태를 metastable state로 볼 수 있습니다.

Hairpin 구조가 Background Reaction을 억제한다

CHA에서 hairpin은 단순한 모양이 아닙니다.

H1과 H2가 처음부터 서로 결합하지 못하게 만드는 kinetic barrier 역할을 합니다.

만약 H1과 H2를 단순한 linear DNA로 만들어 서로 상보적인 sequence를 노출해 놓는다면 target이 없어도 두 strand가 바로 hybridization할 수 있습니다.

그러면 target-independent background가 발생합니다.

CHA에서는 complementary domain을 stem 안에 숨겨 두어 두 hairpin이 상대적으로 안정적인 상태를 유지하도록 합니다.

즉,

Target 없음

→ H1 Closed

→ H2 Closed

→ H1-H2 Assembly 억제

상태가 유지됩니다.

Target이 들어왔을 때만 이 안정 상태가 단계적으로 무너지도록 만드는 것이 CHA 설계의 핵심입니다.

Toehold가 첫 번째 반응을 시작한다

Hairpin 전체 sequence가 stem 내부에 숨겨져 있는 것은 아닙니다.

H1에는 target이 접근할 수 있는 짧은 single-stranded 영역을 노출시킬 수 있습니다.

이를 toehold라고 합니다.

Target nucleic acid에는 이 toehold와 상보적인 sequence가 존재하도록 설계합니다.

Target이 H1의 toehold에 결합하면 첫 번째 hybridization이 시작됩니다.

이 짧은 결합이 단순히 target을 붙잡는 데서 끝나지 않습니다.

Target이 toehold에 결합한 뒤 인접한 stem 영역으로 hybridization을 확장하면서 기존 H1 stem을 구성하던 strand pairing을 순차적으로 밀어낼 수 있습니다.

이 과정이 toehold-mediated strand displacement입니다.

Target이 H1 Hairpin을 연다

처음 H1은 닫힌 hairpin 상태입니다.

Target이 H1의 toehold에 결합하면 branch migration이 진행되면서 H1 stem이 풀리기 시작합니다.

결과적으로 H1은

Closed H1

에서

Target-H1 Complex

형태로 변합니다.

이 구조 변화가 중요한 이유는 H1 내부에 숨겨져 있던 새로운 sequence가 외부로 노출되기 때문입니다.

이 sequence는 다음 단계에서 H2를 인식할 수 있도록 설계됩니다.

즉, target은 단순히 H1과 결합하는 것이 아니라 H1 안에 감춰져 있던 두 번째 reaction domain을 노출시키는 trigger 역할을 합니다.

열린 H1이 H2를 불러온다

Target에 의해 H1이 열리면 이전에는 stem 내부에 있던 H2 recognition domain이 노출됩니다.

H2에는 이 영역과 상보적인 toehold가 존재합니다.

따라서 H2가 열린 H1에 결합할 수 있게 됩니다.

이때 다시 toehold-mediated strand displacement가 시작됩니다.

H1이 H2의 toehold에 결합하고 branch migration이 진행되면서 H2의 stem이 열립니다.

그 결과 처음에는 각각 닫혀 있던 H1과 H2가 서로 결합한 안정적인 duplex assembly를 형성하게 됩니다.

즉,

Target

→ H1 Opening

→ H2 Recognition Site 노출

→ H2 Opening

→ H1-H2 Assembly

순서로 반응이 이어집니다.

가장 중요한 단계는 Target의 방출이다

CHA가 단순한 hybridization reaction과 다른 이유는 여기에서 나타납니다.

처음 H1을 열었던 target은 최종 H1-H2 complex에 반드시 남아 있어야 하는 구성 요소가 아닙니다.

H2가 H1과 결합하면서 strand displacement가 진행되면 처음 H1에 결합했던 target이 다시 밀려나도록 회로를 설계할 수 있습니다.

따라서 최종적으로는

H1-H2 Complex

가 남고

Target은 다시 Free State

로 돌아옵니다.

이것이 CHA에서 ‘Catalytic’이라는 표현이 사용되는 핵심적인 이유입니다.

Target이 반응을 시작하지만 최종 product에 소비되지 않고 다시 다음 reaction cycle에 참여할 수 있기 때문입니다.

하나의 Target이 여러 Hairpin을 조립한다

방출된 target은 새로운 H1을 만날 수 있습니다.

그러면 동일한 과정이 다시 시작됩니다.

첫 번째 cycle에서는

Target + H1 + H2

→ H1-H2 Complex + Target

두 번째 cycle에서는 다시

Target + 새로운 H1 + 새로운 H2

→ 새로운 H1-H2 Complex + Target

이 됩니다.

이 과정이 반복되면 처음에는 target molecule이 하나뿐이더라도 여러 개의 H1-H2 assembly product를 만들 수 있습니다.

따라서 CHA에서 증가하는 것은 target DNA의 copy number가 아닙니다.

증가하는 것은 target에 의해 생성되는 assembly product의 수입니다.

이 차이가 일반적인 nucleic acid amplification과 CHA를 구분하는 중요한 부분입니다.

Target Amplification과 Signal Amplification은 다르다

PCR에서는 하나의 target DNA에서 두 개의 DNA가 만들어지고 반복적인 cycle을 거치면서 target-derived DNA copy가 증가합니다.

LAMP와 RCA에서도 polymerase가 새로운 nucleic acid를 합성합니다.

CHA에서는 polymerase가 없습니다.

새로운 DNA strand도 합성되지 않습니다.

반응에 필요한 H1과 H2는 처음부터 solution 안에 준비되어 있습니다.

Target은 이들의 구조를 바꾸고 assembly를 유도합니다.

따라서 CHA는 엄밀하게 보면 target nucleic acid 자체를 증폭하는 기술이라기보다 target-triggered signal amplification circuit이라고 설명하는 것이 더 적절합니다.

반응을 Domain 단위로 보면 이해하기 쉽다

CHA는 실제로는 여러 nucleotide로 구성된 oligonucleotide를 사용하지만 원리를 이해할 때는 sequence를 domain 단위로 보는 것이 편리합니다.

예를 들어 H1에

a – b – c

와 같은 기능적 domain이 있다고 가정할 수 있습니다.

일부 domain은 stem 형성을 위해 내부적으로 결합하고 특정 domain만 외부에 toehold로 노출됩니다.

Target이 노출된 domain a에 결합하면 strand displacement가 시작됩니다.

그 결과 H1 내부에 숨겨져 있던 b가 노출됩니다.

이 b가 다시 H2의 complementary domain을 인식합니다.

H2가 열리면서 H1과 H2 사이에 더 안정적인 hybridization structure가 만들어지고 target은 방출됩니다.

즉, CHA는 무작위로 hairpin이 열리는 것이 아니라 미리 프로그램한 sequence domain이 정해진 순서로 노출되는 DNA reaction circuit입니다.

반응의 에너지는 어디에서 나올까?

Polymerase도 ATP도 사용하지 않는다면 CHA reaction이 어떻게 진행되는지 궁금할 수 있습니다.

핵심은 nucleic acid hybridization의 thermodynamics입니다.

초기의 H1과 H2는 각각 metastable hairpin으로 존재합니다.

Target이 kinetic barrier를 넘을 수 있는 반응 경로를 열어주면 H1과 H2 사이에 더 많은 안정적인 base pairing을 형성하는 방향으로 reaction이 진행될 수 있습니다.

즉, enzyme이 chemical energy를 공급해 새로운 DNA를 합성하는 것이 아니라 DNA hybridization에서 발생하는 free-energy difference를 이용해 구조적 재배열이 진행됩니다.

Target은 이러한 반응이 시작될 수 있는 pathway를 제공하고 최종적으로 다시 방출됩니다.

CHA 결과를 형광으로 확인하는 방법

H1-H2 complex가 많이 만들어졌다는 사실은 최종적으로 측정 가능한 signal로 바꿔야 합니다.

이를 위해 fluorescence detection을 연결할 수 있습니다.

한 가지 전략은 H1과 H2의 assembly 전후에 fluorophore와 quencher 사이의 거리가 변하도록 설계하는 것입니다.

초기 hairpin 상태에서는 fluorescence가 억제되고 H1-H2 complex가 형성되면 fluorophore와 quencher가 분리되면서 fluorescence가 증가하도록 구성할 수 있습니다.

또 다른 방법은 CHA product가 별도의 fluorescent reporter system을 활성화하도록 설계하는 것입니다.

따라서 CHA의 핵심 reaction과 signal readout은 반드시 동일한 구조일 필요가 없습니다.

CHA → Amplification

Fluorescent Reporter → Detection

처럼 역할을 분리할 수도 있습니다.

Molecular Beacon과 무엇이 다를까?

앞선 글에서 살펴본 molecular beacon 역시 hairpin 구조를 사용합니다.

하지만 두 기술의 목적은 다릅니다.

Molecular beacon에서는 하나의 target이 하나의 probe를 열면 fluorescence가 발생합니다.

기본적으로

Target 1개 → Beacon Opening

이라는 직접적인 recognition 구조입니다.

CHA에서는 target이 H1을 연 뒤 H2 assembly를 유도하고 다시 방출됩니다.

방출된 target은 다른 H1을 다시 열 수 있습니다.

따라서

Target 1개 → 여러 H1-H2 Complex

를 만들 수 있습니다.

즉, molecular beacon의 hairpin은 주로 signal switching을 담당하지만 CHA의 hairpin은 catalytic reaction circuit과 signal amplification을 구성합니다.

HCR과도 구별해야 한다

CHA와 함께 자주 언급되는 enzyme-free amplification 방법으로 Hybridization Chain Reaction(HCR)이 있습니다.

두 방법 모두 metastable hairpin과 strand displacement를 활용하지만 최종 product가 다릅니다.

일반적인 HCR에서는 initiator가 첫 번째 hairpin을 열고 열린 hairpin이 다음 hairpin을 열면서 chain reaction이 이어집니다.

그 결과 H1과 H2가 반복적으로 연결된 긴 nicked double-stranded polymer가 만들어질 수 있습니다.

반면 일반적인 CHA에서는 target이 H1-H2 assembly를 유도한 뒤 다시 방출되어 새로운 reaction cycle을 촉진합니다.

최종적으로는 개별적인 H1-H2 complex가 다수 축적되는 형태로 설명할 수 있습니다.

따라서

HCR → Chain Growth

CHA → Catalytic Turnover

라는 차이를 중심으로 이해하면 두 기술을 구별하기 쉽습니다.

miRNA 검출에 CHA가 연구되는 이유

CHA의 target은 다양한 nucleic acid sequence로 설계할 수 있습니다.

특히 miRNA와 같은 짧은 RNA를 trigger로 사용하는 연구가 가능합니다.

특정 miRNA가 H1의 toehold와 결합하도록 sequence를 설계하면 해당 miRNA가 존재할 때만 CHA reaction을 시작하도록 만들 수 있습니다.

Target miRNA는 H1을 열고 H2 assembly를 유도한 뒤 다시 방출됩니다.

따라서 하나의 miRNA molecule이 반복적으로 reaction cycle에 참여할 수 있습니다.

이는 target 자체를 enzymatically 복제하지 않으면서도 극소량의 miRNA 정보를 여러 assembly product로 변환할 수 있다는 의미입니다.

다만 실제 biological sample에서의 detection limit과 specificity는 hairpin 설계, reaction kinetics, sample matrix 등에 따라 크게 달라질 수 있습니다.

Single Nucleotide 차이도 구별할 수 있을까?

CHA에서도 target recognition sequence를 적절하게 설계하면 single-base mismatch discrimination을 연구할 수 있습니다.

Target이 H1의 toehold와 branch migration domain에 정확하게 결합하면 hairpin opening이 효율적으로 진행될 수 있습니다.

반대로 mismatch가 존재하면 strand displacement kinetics가 감소할 수 있습니다.

특히 mismatch가 toehold 또는 branch migration에 중요한 위치에 존재하면 reaction rate 차이를 만들 수 있습니다.

하지만 CHA가 사용됐다는 사실만으로 single nucleotide specificity가 자동으로 확보되는 것은 아닙니다.

Mismatch 위치, toehold 길이, reaction temperature, sequence composition 등을 함께 최적화해야 합니다.

CHA의 장점은 Enzyme-Free라는 점에 있다

CHA에서는 polymerase, ligase, nicking enzyme과 같은 protein enzyme 없이 reaction circuit을 구성할 수 있습니다.

따라서 enzyme activity에 맞춰 여러 biochemical condition을 조정해야 하는 부담을 줄일 수 있습니다.

또한 DNA oligonucleotide sequence 자체를 변경해 새로운 target에 맞는 reaction circuit을 설계할 수 있습니다.

이러한 programmable characteristic은 DNA nanotechnology와 biosensor 분야에서 중요한 장점입니다.

다만 enzyme-free라는 표현이 ‘조건에 영향을 받지 않는다’는 의미는 아닙니다.

DNA hybridization 역시 temperature, ionic strength, sequence composition과 concentration에 영향을 받습니다.

따라서 CHA에서도 reaction condition optimization이 필요합니다.

가장 큰 문제 가운데 하나는 Leakage다

CHA의 성능을 결정하는 중요한 요소가 leakage reaction입니다.

이론적으로는 target이 없으면 H1과 H2가 각각 닫힌 상태를 유지해야 합니다.

하지만 실제 solution에서는 모든 molecule이 완벽하게 고정된 구조로 존재하지 않습니다.

Hairpin이 일시적으로 열리거나 H1과 H2 사이에 예상하지 않은 interaction이 발생할 수 있습니다.

그 결과 target이 없어도 소량의 H1-H2 complex가 생성될 수 있습니다.

이러한 target-independent reaction을 leakage 또는 background reaction이라고 합니다.

Reaction time이 길어지면 작은 leakage도 누적될 수 있기 때문에 낮은 target concentration을 검출할 때 문제가 됩니다.

Hairpin을 너무 안정하게 만들면 해결될까?

Leakage를 줄이기 위해 stem을 매우 안정적으로 만들면 좋을 것처럼 보입니다.

하지만 지나치게 안정적인 stem은 또 다른 문제를 만듭니다.

Target이 존재해도 H1을 충분히 빠르게 열지 못할 수 있기 때문입니다.

그러면 desired reaction의 kinetics가 느려집니다.

따라서 CHA 설계에는 항상 trade-off가 존재합니다.

Hairpin Stability 증가

→ Leakage 감소 가능

하지만 동시에

→ Target-triggered Opening 감소 가능

가 됩니다.

반대로 stem을 너무 약하게 만들면 target response는 빨라질 수 있지만 spontaneous opening과 leakage가 증가할 수 있습니다.

좋은 CHA system은 이 두 조건 사이에서 적절한 balance를 찾아야 합니다.

Toehold 길이도 반응속도에 영향을 준다

Toehold는 strand displacement가 시작되는 출발점입니다.

일반적으로 target이 toehold에 안정적으로 결합할 수 있어야 이후 branch migration이 진행될 수 있습니다.

Toehold가 지나치게 짧으면 initial binding probability가 낮아 reaction이 느려질 수 있습니다.

반대로 지나치게 강한 toehold interaction은 unwanted interaction이나 specificity에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 target sequence에 따라 적절한 toehold domain을 설계하는 것이 중요합니다.

CHA는 단순히 두 hairpin의 sequence를 상보적으로 만드는 것이 아니라 reaction kinetics 자체를 nucleotide sequence로 프로그래밍하는 기술이라는 점이 여기에서 드러납니다.

다른 증폭 기술과 Cascade로 연결할 수도 있다

CHA 하나만으로 signal을 증폭할 수도 있지만 다른 molecular amplification system과 연결하는 연구도 가능합니다.

예를 들어 upstream reaction에서 만들어진 특정 nucleic acid product를 CHA trigger로 사용할 수 있습니다.

반대로 CHA에서 생성된 H1-H2 complex가 다음 DNA circuit이나 fluorescent reporter를 활성화하도록 설계할 수도 있습니다.

이러한 방식으로

Target Recognition

→ First Amplification

→ CHA

→ Signal Generation

과 같은 cascade circuit을 구성할 수 있습니다.

여러 amplification을 연결하면 sensitivity를 높일 가능성이 있지만 단계가 증가할수록 background와 nonspecific reaction 역시 함께 고려해야 합니다.

따라서 cascade가 많다고 항상 더 좋은 assay가 되는 것은 아닙니다.

CHA 전체 반응을 정리하면

가장 기본적인 CHA mechanism은 다음과 같이 정리할 수 있습니다.

Target이 없는 경우

H1 Closed

H2 Closed

→ 상호반응 억제

→ Low Background Signal

Target이 존재하는 경우

Target

→ H1 Toehold 결합

→ Strand Displacement

→ H1 Opening

→ H2 Recognition Domain 노출

→ H2 결합

→ H2 Opening

→ H1-H2 Complex 형성

→ Target 방출

그리고 방출된 target은 다시

새로운 H1 인식

→ 새로운 H1-H2 Complex 형성

과정을 반복합니다.

결과적으로

하나의 Target

→ 여러 H1-H2 Assembly Products

로 변환됩니다.

CHA가 분자진단 연구에서 갖는 의미

CHA의 특징은 target nucleic acid를 복제하지 않고도 signal amplification을 구현한다는 것입니다.

PCR에서는 DNA polymerase가 target-derived DNA를 새로 합성합니다.

RCA에서는 circular template를 반복해서 복제합니다.

EXPAR에서는 polymerase와 nicking enzyme을 이용해 짧은 oligonucleotide product를 빠르게 생성합니다.

CHA에서는 이와 달리 이미 합성되어 있는 DNA hairpin들의 구조적 potential energy와 sequence-programmed strand displacement를 이용합니다.

Target은 새로운 nucleic acid의 재료가 아니라 reaction을 반복적으로 촉진하는 trigger가 됩니다.

따라서 CHA는 핵산을 단순한 유전정보 저장물질이 아니라 스스로 조립되고 반응 순서를 실행할 수 있는 programmable molecular component로 활용한다는 점에서 의미가 있습니다.

마치며

Catalytic Hairpin Assembly는 두 개 이상의 metastable DNA hairpin과 target-triggered strand displacement를 이용하는 enzyme-free signal amplification 기술입니다.

Target이 없을 때 H1과 H2는 각각 hairpin을 형성해 서로의 complementary sequence를 숨기고 있습니다.

Target이 H1의 toehold에 결합하면 strand displacement를 통해 H1이 열리고 H2를 인식할 수 있는 새로운 sequence가 노출됩니다.

H2가 열린 H1과 결합하면서 다시 strand displacement가 진행되고 최종적으로 안정적인 H1-H2 complex가 만들어집니다.

이 과정에서 처음 반응을 시작했던 target은 다시 방출됩니다.

따라서 전체 원리는

Target Recognition

→ H1 Opening

→ H2 Opening

→ H1-H2 Assembly

→ Target Recycling

→ 반복적인 Assembly

로 정리할 수 있습니다.

CHA에서 가장 중요한 것은 DNA의 양을 enzymatically 증가시키는 것이 아닙니다.

하나의 target이 소비되지 않은 채 반복적으로 여러 hairpin assembly를 만들어내도록 분자회로를 설계했다는 점입니다.

이 때문에 CHA는 target recycling을 이용한 enzyme-free signal amplification 기술로서 miRNA와 특정 DNA sequence를 검출하는 다양한 biosensor 연구에 활용되고 있습니다.

동시에 실제 성능을 높이려면 target이 없을 때 발생하는 leakage를 억제하면서 target이 존재할 때 충분히 빠른 strand displacement가 일어나도록 hairpin stability와 toehold를 정밀하게 설계해야 합니다.

※ 본 글은 Catalytic Hairpin Assembly의 핵산 신호 증폭 원리를 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠이며 특정 질환에 대한 임상 진단 성능을 의미하지 않습니다.