G-Triplex DNAzyme을 활용한 miRNA 비색 검출 기술의 원리

특정 구조를 형성한 DNA는 단백질 효소와 유사한 촉매 활성을 나타낼 수 있습니다. 이번 글에서는 G-triplex의 peroxidase-mimicking activity와 RCA를 결합해 miRNA를 검출한 연구를 살펴보겠습니다.

단백질이 아닌 DNA도 촉매 활성을 가질 수 있다

우리 몸에서는 다양한 enzyme이 생화학 반응에 관여합니다. 일반적으로 효소라고 하면 특정 반응을 촉진하는 단백질을 생각하기 쉽습니다.

하지만 단백질이 아닌 핵산도 특정 조건에서는 효소와 유사한 촉매 기능을 나타낼 수 있습니다.

특정 염기서열을 가진 DNA가 금속 이온이나 보조인자와 함께 독특한 구조를 형성하고 촉매 활성을 나타내는 경우 이를 DNAzyme이라고 합니다.

RNA 역시 특정 구조를 통해 촉매 기능을 가질 수 있으며, 이러한 촉매성 RNA는 일반적으로 ribozyme으로 알려져 있습니다.

DNAzyme과 촉매성 RNA는 구조와 종류에 따라 핵산 절단이나 연결 등 다양한 반응에 관여할 수 있습니다.

이번 논문에서는 여러 DNAzyme 가운데 peroxidase-mimicking activity를 나타내는 G-rich DNA 구조를 핵산 검출에 활용했습니다.

검출 대상인 microRNA는 어떤 특징이 있을까?

논문에서 검출 대상으로 다룬 핵산은 microRNA(miRNA)입니다.

miRNA는 약 18~24개의 염기서열로 이루어진 짧은 single-stranded RNA로, 세포 안에서 유전자 발현을 조절하는 데 관여합니다.

특정 miRNA의 발현 변화는 암과 같은 질환과의 관련성이 연구되고 있어 cancer biomarker 후보로도 활용 가능성이 연구되고 있습니다.

하지만 miRNA를 정확하게 검출하려면 몇 가지 어려움을 해결해야 합니다.

우선 표적 miRNA의 양이 매우 적을 수 있고, 핵산 자체의 길이도 짧습니다. 같은 miRNA family에 포함되는 sequence 사이의 유사도가 매우 높은 경우도 있습니다.

RNA 특성상 degradation 가능성도 있기 때문에 낮은 농도의 표적을 선택적으로 검출하는 기술이 필요합니다.

이러한 특징 때문에 miRNA 검출에서는 표적을 정확하게 인식하는 과정과 함께 충분한 검출 신호를 확보할 수 있는 amplification 과정이 중요합니다.

RT-PCR과 등온 핵산 증폭 기술

miRNA와 같은 RNA를 검출하기 위해 널리 이용되는 방법 가운데 하나가 reverse transcription을 포함하는 PCR 기반 기술입니다.

RT-PCR은 높은 민감도와 특이도로 핵산을 분석할 수 있다는 장점이 있습니다.

반면 PCR amplification을 수행하려면 온도를 반복적으로 변화시키는 thermal cycling 과정이 필요하기 때문에 thermal cycler를 사용해야 합니다.

이러한 장비 의존성을 줄일 수 있는 방법 가운데 하나로 isothermal nucleic acid amplification 기술이 연구되고 있습니다.

대표적으로 Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP), Recombinase Polymerase Amplification(RPA), Nucleic Acid Sequence-Based Amplification(NASBA) 등이 있습니다.

이번 논문에서 연구진이 선택한 증폭 방법은 Rolling Circle Amplification(RCA)​입니다.

RCA는 원형 DNA를 template로 사용해 긴 핵산 증폭산물을 생성할 수 있다는 특징을 가지고 있습니다.

연구진은 이 RCA를 miRNA 검출뿐 아니라 최종 DNAzyme 구조를 반복적으로 만들어내는 과정에도 활용했습니다.

G-Quadruplex에서 G-Triplex로 바꾼 이유

논문에서는 본격적인 검출 기술을 설명하기 전에 G-quadruplex DNAzyme을 다룹니다.

G-quadruplex는 guanine이 풍부한 G-rich sequence가 형성할 수 있는 핵산 구조입니다.

특정 G-quadruplex가 hemin과 결합하면 peroxidase와 유사한 활성을 나타낼 수 있기 때문에 이러한 특성을 핵산 검출 신호로 이용하는 연구가 진행되어 왔습니다.

하지만 논문에서는 RCA를 통해 G-quadruplex를 생성할 경우 반복적으로 만들어지는 G-rich sequence가 분자 내부 또는 서로 다른 분자 사이에서 예상하지 않은 형태로 접히거나 뭉칠 가능성을 문제로 제시합니다.

연구진이 이에 대한 대안으로 주목한 구조가 G-triplex입니다.

G-triplex 역시 G-rich sequence에서 형성되는 구조이며 peroxidase-mimicking DNAzyme으로 활용할 수 있습니다.

특히 G-quadruplex와 비교해 상대적으로 짧은 sequence로 구성할 수 있다는 점에서 RCA와 결합할 수 있는 구조로 연구됐습니다.

G-Triplex와 G-Quadruplex의 활성을 비교하다

연구진은 miRNA 검출 모식도를 제안하기 전에 G-quadruplex와 G-triplex가 나타내는 DNAzyme activity를 비교했습니다.

실험 결과에서는 두 구조 모두 peroxidase-mimicking activity를 나타냈으며 그 활성 역시 유사한 수준으로 관찰됐습니다.

하지만 G-rich sequence를 여러 개 연결했을 때는 다른 특징이 나타났습니다.

G-triplex를 하나만 사용하는 것이 아니라 두 개 또는 세 개가 연속적으로 위치하도록 만든 G-triplex dimer와 G-triplex trimer에서 더 높은 활성이 나타난 것입니다.

즉, G-triplex 자체의 특성뿐 아니라 G-rich sequence를 연속적으로 배열하는 multimer 구조가 catalytic activity에 영향을 줄 수 있다는 것을 확인한 것입니다.

연구진은 이 결과를 바탕으로 G-triplex trimer를 실제 miRNA 검출 기술에 적용했습니다.

Padlock Probe가 표적 miRNA를 인식한다

논문에서 제안한 miRNA 검출은 표적 핵산과 padlock probe의 결합에서 시작합니다.

표적 miRNA가 존재하면 이에 상보적으로 설계된 padlock probe가 결합합니다.

논문에서 사용한 구조에서는 miRNA와 padlock probe가 대부분 상보적으로 결합하고 중간에 하나의 base가 결합하지 않은 형태로 설계되어 있습니다.

이 상태에서 ligase가 작용하면 padlock probe의 양 끝 말단이 서로 연결됩니다.

처음에는 선형이었던 padlock probe가 ligation을 거치면서 원형 DNA로 바뀌는 것입니다.

이렇게 생성된 circular DNA는 다음 단계인 RCA에서 template 역할을 담당합니다.

즉, 표적 miRNA의 인식 결과를 원형 DNA의 생성으로 연결하고, 이를 다시 핵산 증폭으로 이어지도록 설계한 것입니다.

miRNA를 Primer로 RCA가 진행된다

Padlock probe의 ligation으로 circular DNA가 만들어지면 DNA polymerase에 의해 RCA가 진행됩니다.

여기에서는 표적 miRNA가 primer 역할을 합니다.

DNA polymerase가 miRNA를 시작점으로 circular DNA를 따라가면서 DNA를 합성하면 매우 긴 single-stranded DNA product가 만들어집니다.

원형 template를 이용하기 때문에 polymerase는 동일한 template sequence를 반복적으로 복제할 수 있습니다.

따라서 하나의 circular DNA로부터 동일한 sequence가 여러 번 이어진 긴 DNA를 생성할 수 있습니다.

이러한 RCA의 특징은 이번 논문에서 표적 miRNA의 신호를 증가시키는 데 중요한 역할을 합니다.

하지만 이 연구에서 RCA의 역할은 단순한 핵산 증폭에서 끝나지 않습니다.

RCA를 이용해 G-Triplex Trimer를 반복 생성한다

논문의 핵심적인 설계가 이 부분입니다.

RCA에서 사용되는 circular DNA에는 G-triplex trimer와 상보적인 sequence가 포함되어 있습니다.

따라서 DNA polymerase가 circular template를 반복해서 복제하면 생성되는 긴 single-stranded DNA 안에 G-rich sequence 역시 반복적으로 만들어집니다.

이러한 sequence는 G-triplex 구조를 형성할 수 있습니다.

특히 연구진은 앞선 실험에서 높은 활성을 확인했던 G-triplex trimer가 반복적으로 생성되도록 RCA를 설계했습니다.

따라서 RCA가 진행될수록 긴 DNA만 만들어지는 것이 아니라 peroxidase-mimicking activity에 사용할 수 있는 G-rich 구조 역시 계속 증가합니다.

이를 간단하게 정리하면 다음과 같습니다.

Target miRNA

→ Padlock Probe 결합

→ Ligation

→ Circular DNA 형성

→ RCA

→ G-Triplex Trimer 반복 생성

이러한 구조 때문에 RCA amplification과 DNAzyme 생성이 서로 연결될 수 있습니다.

Hemin과 결합해 Peroxidase-Mimicking Activity를 만든다

RCA를 통해 생성된 G-triplex trimer는 이후 hemin과 결합합니다.

Hemin은 G-rich DNA 구조와 결합해 peroxidase와 유사한 catalytic activity를 나타내는 데 중요한 역할을 합니다.

따라서 이번 검출 기술에서는

G-Triplex Trimer + Hemin

결합을 통해 peroxidase-mimicking DNAzyme이 만들어집니다.

여기서 중요한 점은 G-triplex DNAzyme이 표적 miRNA를 직접 인식하는 것이 아니라는 것입니다.

앞부분의 padlock probe가 표적을 인식하고 RCA가 그 결과를 증폭한 뒤, 최종적으로 생성된 G-triplex trimer가 hemin과 결합해 신호를 만드는 역할을 담당합니다.

ABTS 산화반응을 비색 신호로 이용한다

마지막 단계에서는 G-triplex trimer/hemin이 나타내는 peroxidase-mimicking activity를 실제 검출 신호로 변환합니다.

논문에서는 이를 위해 ABTS를 이용했습니다.

G-triplex trimer와 hemin이 형성한 DNAzyme은 적절한 반응 조건에서 ABTS의 산화를 촉진합니다.

ABTS가 산화되면서 색 변화가 나타나기 때문에 최종적으로 표적 miRNA의 존재를 colorimetric detection으로 확인할 수 있습니다.

따라서 논문에서 제안한 전체 검출 원리는 다음과 같이 연결됩니다.

miRNA 인식

→ Padlock Probe 원형화

→ RCA

→ G-Triplex Trimer 생성

→ Hemin 결합

→ Peroxidase-Mimicking Activity

→ ABTS 산화

→ 비색 신호 발생

짧고 양이 적은 miRNA의 존재를 RCA로 증폭하고, 그 증폭 결과를 DNAzyme의 catalytic activity를 이용해 색 신호로 바꾸는 방식입니다.

이 논문에서 흥미로운 부분

이번 연구에서 주목할 점은 기존에 많이 연구된 G-quadruplex가 아닌 상대적으로 짧은 G-triplex 구조를 miRNA 검출에 활용했다는 것입니다.

특히 단일 G-triplex만 사용하는 것이 아니라 G-rich sequence를 연속적으로 배치했을 때 나타나는 활성 변화를 확인했습니다.

그 결과를 바탕으로 G-triplex dimer와 trimer 가운데 높은 활성을 보인 구조를 실제 RCA 기반 검출 기술과 연결했습니다.

RCA 역시 단순히 miRNA 신호를 증폭하는 용도로만 사용하지 않았습니다.

Circular template의 sequence를 설계해 RCA가 진행될수록 G-triplex trimer 자체가 반복적으로 생성되도록 만들었다는 점이 이 기술의 중요한 특징입니다.

결국 표적 miRNA가 padlock probe와 결합하면 circular DNA가 만들어지고, miRNA를 primer로 RCA가 진행됩니다.

여기에서 반복적으로 생성된 G-triplex trimer는 hemin과 결합해 peroxidase-mimicking activity를 나타내고, 마지막으로 ABTS를 산화시켜 비색 신호를 만들어냅니다.

즉, miRNA 인식과 RCA 증폭, 기능성 DNA 구조 생성, DNAzyme 촉매반응을 하나의 검출 시스템으로 연결했다는 점​에서 흥미로운 연구라고 볼 수 있습니다.

※ 이 글은 G-triplex 기반 peroxidase-mimicking DNAzyme과 RCA를 이용한 miRNA 검출 연구를 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다.