CUT&Tag 원리: 항체와 Tn5 전이효소로 히스톤 변형 위치를 분석하는 방법

DNA 염기서열이 같더라도 유전자 발현 상태는 달라질 수 있습니다. 히스톤 변형과 전사인자의 결합이 염색질 상태에 영향을 주기 때문입니다. CUT&Tag는 항체와 Tn5 전이효소를 이용해 특정 단백질이 존재하는 유전체 위치를 선택적으로 분석하는 기술입니다.

1. DNA 서열이 같아도 유전자 발현이 달라지는 이유

사람의 체세포는 대부분 동일한 유전체 정보를 가지고 있지만, 세포 종류에 따라 발현하는 유전자는 다릅니다.

이러한 차이는 전사인자와 염색질 구조, 히스톤 변형 등 여러 조절 기전에 영향을 받습니다.

DNA는 히스톤 단백질과 결합해 뉴클레오솜(nucleosome)을 형성합니다.

히스톤 단백질에는 메틸화와 아세틸화 같은 화학적 변형이 발생할 수 있습니다.

대표적인 히스톤 변형에는 H3K4me3, H3K27ac, H3K27me3 등이 있습니다.

이러한 변형은 서로 다른 염색질 상태와 관련이 있습니다.

예를 들어 H3K4me3는 활성 promoter 부근에서 자주 관찰됩니다. H3K27ac는 활성 enhancer 및 promoter와 관련이 있으며, H3K27me3는 Polycomb에 의한 유전자 억제 상태와 연관됩니다.

하지만 이러한 표지가 특정 위치에 존재한다는 사실만으로 해당 유전자의 발현 상태를 확정할 수는 없습니다.

CUT&Tag는 이러한 히스톤 변형과 DNA 결합 단백질이 유전체의 어느 위치에 존재하는지 분석하는 방법입니다.

2. CUT&Tag라는 이름은 무엇을 의미할까?

CUT&Tag는 Cleavage Under Targets and Tagmentation의 약자입니다.

표적 단백질 주변에서 DNA를 절단하고 시퀀싱 어댑터를 삽입한다는 의미입니다.

이 기술은 2019년 Kaya-Okur와 연구진이 Nature Communications에 발표했습니다.

기존 ChIP-seq은 염색질을 절단하고 특정 단백질에 결합한 DNA 조각을 면역침강으로 회수하는 방식입니다.

반면 CUT&Tag는 투과화한 세포 또는 세포핵 안에서 항체가 인식한 위치에 효소를 직접 유도합니다.

효소가 표적 부근의 DNA를 절단하면서 시퀀싱 어댑터까지 삽입하기 때문에 후속 라이브러리 제작 과정이 간소화됩니다.

이때 사용되는 핵심 효소가 Tn5 transposase입니다.

3. Tn5 전이효소는 어떤 역할을 할까?

Tn5는 DNA에 작용하는 전이효소(transposase)입니다.

CUT&Tag에서는 시퀀싱 어댑터가 미리 결합된 Tn5 복합체를 사용합니다.

Tn5가 활성화되면 DNA를 절단하는 동시에 어댑터를 삽입할 수 있습니다.

이러한 반응을 tagmentation이라고 합니다.

일반적인 CUT&Tag에서는 Tn5를 Protein A와 결합한 pA-Tn5 융합 단백질 형태로 사용합니다.

Protein A는 항체의 Fc 영역과 결합할 수 있습니다.

따라서 항체가 특정 히스톤 변형이나 전사인자를 인식하면 pA-Tn5가 그 위치에 모이도록 유도할 수 있습니다.

다만 Protein A와 항체의 결합 특성은 항체 종류에 따라 달라집니다.

일부 실험에서는 Protein G가 결합된 형태나 2차 항체를 활용하기도 합니다.

중요한 것은 Tn5가 DNA 전체에 무작위로 작용하도록 두는 것이 아니라, 항체가 인식한 염색질 위치에 상대적으로 집중되도록 설계한다는 점입니다.

4. CUT&Tag의 실험 과정

CUT&Tag의 대표적인 분석 과정은 다음과 같습니다.

1. 세포 또는 세포핵을 준비하고 항체가 내부에 접근할 수 있도록 처리합니다.
2. 분석하려는 히스톤 변형이나 DNA 결합 단백질에 특이적인 1차 항체를 반응시킵니다.
3. 필요한 경우 2차 항체를 이용해 결합을 보조합니다.
4. 시퀀싱 어댑터가 결합된 pA-Tn5를 반응시킵니다.
5. 결합하지 않은 효소를 세척해 제거합니다.
6. 마그네슘 이온을 이용해 Tn5를 활성화하고 표적 주변 DNA를 tagmentation합니다.
7. DNA를 정제하고 PCR로 라이브러리를 증폭한 뒤 시퀀싱합니다.

시퀀싱 결과는 기준 유전체에 정렬합니다.

특정 유전체 위치에 read가 집중적으로 나타난다면 해당 위치에 표적 히스톤 변형 또는 단백질이 존재했을 가능성을 검토할 수 있습니다.

그러나 read가 많다는 사실만으로 표적 단백질의 절대적인 분자 수를 직접 계산할 수는 없습니다.

항체 결합 효율과 Tn5 접근성, PCR 증폭 과정 등이 결과에 영향을 주기 때문입니다.

5. CUT&Tag가 적은 세포 수에서도 작동하는 이유

CUT&Tag의 특징 가운데 하나는 상대적으로 적은 세포 수에서도 분석할 수 있다는 점입니다.

2019년 원천 연구에서는 사람 K562 세포를 대상으로 H3K27me3를 분석했습니다.

연구진은 세포 수를 100,000개에서 60개까지 줄인 조건에서도 유사한 염색질 표지 패턴을 얻었다고 보고했습니다.

또한 단일세포 CUT&Tag의 가능성도 제시했습니다.

이러한 결과가 가능한 이유 중 하나는 표적 단백질 주변에서 DNA 라이브러리가 선택적으로 생성되기 때문입니다.

일반적인 DNA 절단 후 면역침강하는 방법과 달리, 표적 주변의 DNA를 직접 라이브러리로 전환할 수 있습니다.

따라서 비특이적 DNA 조각이 상대적으로 적게 포함될 수 있습니다.

다만 60개 세포에서 분석에 성공했다는 연구 결과가 모든 항체와 세포 종류에 동일하게 적용되는 것은 아닙니다.

표적 단백질의 양과 항체 성능, 검체 상태에 따라 필요한 세포 수는 달라집니다.

6. CUT&Tag와 ChIP-seq은 무엇이 다를까?

두 기술 모두 특정 단백질과 관련된 유전체 위치를 분석할 수 있습니다.

하지만 DNA 조각을 확보하는 방법이 다릅니다.

비교 기준	CUT&Tag	ChIP-seq
기본 원리	항체로 표적화한 Tn5의 DNA 절단 및 어댑터 삽입	염색질 절단 후 항체 면역침강
대표적 효소	Tn5 전이효소	절단법에 따라 초음파 또는 효소 활용
DNA 회수 방식	표적 부근에서 라이브러리 생성	항체 결합 DNA 조각 회수
세포 수 요구량	적은 세포에서도 분석 가능	일반적으로 더 많은 검체가 필요한 경우가 있음
배경 신호	낮은 배경 신호를 얻을 수 있음	실험 조건에 따라 비특이적 DNA 포함 가능
주요 제한 요소	항체 특이성과 Tn5 접근성	항체 특이성과 면역침강 효율

CUT&Tag가 모든 상황에서 ChIP-seq보다 우수하다는 의미는 아닙니다.

ChIP-seq은 다양한 고정 조건과 단백질 표적에 대한 축적된 분석 경험이 있습니다.

반면 CUT&Tag는 특정 항체와 세포 조건에서 최적화가 필요할 수 있습니다.

따라서 분석 목적과 검체 상태에 따라 적절한 방법을 선택해야 합니다.

7. 2019년 연구에서 확인된 시퀀싱 효율

Kaya-Okur 연구진은 CUT&Tag와 기존 염색질 분석법의 시퀀싱 효율을 비교했습니다.

원천 연구에서는 특정 히스톤 변형을 분석할 때 약 200만 개의 CUT&Tag read로 얻은 peak 내 read 비율이 CUT&RUN 약 800만 개 또는 ChIP-seq 약 2,000만 개에서 얻은 결과와 비교 가능한 수준이었다고 보고했습니다.

또한 CUT&Tag에서는 peak 안에 포함되는 read의 비율이 약 0.6에 도달하는 결과를 제시했습니다.

이 수치는 특정 실험 조건에서 얻은 결과입니다.

모든 CUT&Tag 실험에서 200만 개의 read만으로 충분하다는 의미는 아닙니다.

예를 들어 넓은 유전체 영역에 분포하는 히스톤 변형과 좁은 결합 부위를 가진 전사인자는 서로 다른 시퀀싱 깊이가 필요할 수 있습니다.

또한 분석하려는 유전체의 크기와 검체 품질, 반복 실험의 목적에 따라서도 필요한 read 수가 달라집니다.

따라서 시퀀싱 깊이는 고정된 숫자보다 표적의 특성과 분석 목적에 맞춰 결정해야 합니다.

8. H3K27me3와 H3K4me3는 어떻게 구별할까?

CUT&Tag에서는 분석하려는 히스톤 변형에 맞는 항체를 사용합니다.

예를 들어 H3K27me3 항체를 사용하면 해당 표지가 존재하는 유전체 구간을 분석할 수 있습니다.

H3K4me3 항체를 사용하면 활성 promoter와 관련된 표지의 분포를 분석할 수 있습니다.

두 표지는 생물학적으로 서로 다른 염색질 상태와 연관됩니다.

히스톤 변형	일반적으로 관련된 특징	해석 시 주의점
H3K4me3	활성 promoter	모든 유전자 발현량을 직접 의미하지 않음
H3K27ac	활성 enhancer 및 promoter	표지만으로 조절 대상 유전자를 확정할 수 없음
H3K27me3	Polycomb 관련 유전자 억제	표지가 존재해도 전사 상태는 추가 확인 필요
H3K4me1	Enhancer 관련 영역	활성·비활성 상태를 단독으로 구별하기 어려움

특히 H3K4me3와 H3K27me3가 동일한 유전자 주변에서 관찰되는 경우에는 해석에 주의해야 합니다.

서로 다른 세포 집단에서 얻은 신호가 혼합됐을 수 있기 때문입니다.

따라서 두 표지가 같은 세포에서 함께 존재하는지 확인하려면 단일세포 분석이나 추가적인 실험 설계가 필요할 수 있습니다.

9. CUT&Tag에서 Peak는 무엇을 의미할까?

CUT&Tag 시퀀싱 데이터를 기준 유전체에 정렬하면 특정 위치에 read가 집중적으로 나타날 수 있습니다.

이처럼 주변보다 read가 많이 관찰되는 영역을 peak라고 합니다.

예를 들어 H3K4me3 CUT&Tag에서 특정 유전자의 promoter 주변에 peak가 나타났다고 가정하겠습니다.

이는 해당 위치에 H3K4me3 표지가 존재할 가능성을 보여줍니다.

하지만 peak가 존재한다는 사실만으로 해당 유전자가 높은 수준으로 발현된다고 확정할 수는 없습니다.

유전자 발현량은 RNA-seq이나 RT-qPCR 등으로 별도로 확인해야 합니다.

Peak가 높으면 히스톤 변형도 많은 것일까?

반드시 그렇지는 않습니다.

Peak 높이는 표적의 양뿐 아니라 항체 결합 효율, Tn5 반응 효율, PCR 증폭, 시퀀싱 깊이의 영향을 받습니다.

따라서 서로 다른 검체의 peak 높이를 직접 비교하려면 적절한 정규화가 필요합니다.

특히 전반적인 히스톤 변형 수준이 크게 달라지는 실험에서는 일반적인 read 수 정규화만으로 실제 생물학적 차이를 정확히 반영하지 못할 수 있습니다.

10. 가상의 CUT&Tag 데이터로 보는 Peak 해석

특정 유전자 promoter에서 H3K4me3 CUT&Tag를 수행했다고 가정하겠습니다.

두 검체의 read 수는 다음과 같습니다.

분석 항목	검체 A	검체 B
전체 유효 read	500만 개	1,000만 개
해당 promoter의 read	500개	800개
100만 read당 해당 영역 read	100개	80개

단순한 read 수만 보면 검체 B에서 promoter 신호가 더 높습니다.

그러나 전체 시퀀싱 깊이를 고려하면 검체 A에서 100만 read당 read 수가 더 높습니다.

따라서 전체 read 수가 다른 검체를 비교할 때는 단순한 read 수만으로 결론을 내려서는 안 됩니다.

다만 이 계산 역시 설명을 위한 가상 사례입니다.

실제 CUT&Tag 분석에서는 라이브러리 복잡도와 중복 read, 배경 신호, 표적 분포 등을 함께 고려해야 합니다.

또한 100만 read당 read 수를 계산했다고 해서 서로 다른 검체의 히스톤 변형량을 정확하게 정량할 수 있는 것은 아닙니다.

11. CUT&Tag에서 위양성이 발생하는 원인

CUT&Tag는 낮은 배경 신호를 얻을 수 있지만 모든 비특이적 반응을 제거하는 것은 아닙니다.

대표적인 원인은 다음과 같습니다.

항체의 비특이적 결합

항체가 표적이 아닌 단백질이나 다른 히스톤 변형을 인식하면 잘못된 위치에서 신호가 발생할 수 있습니다.

따라서 항체의 특이성을 검증하는 것이 중요합니다.

Tn5의 비표적 DNA 접근

Tn5는 접근 가능한 DNA에 결합할 수 있는 특성을 가지고 있습니다.

따라서 항체에 의해 표적화되지 않은 DNA에서도 일부 tagmentation이 발생할 수 있습니다.

2020년 개선된 CUT&Tag 프로토콜에서는 이러한 DNA 접근성 관련 인공 신호를 줄이기 위한 조건을 제시했습니다.

PCR 증폭 편향

특정 DNA 조각이 PCR에서 더 효율적으로 증폭되면 해당 위치의 read 수가 과대평가될 수 있습니다.

따라서 중복 read와 라이브러리 복잡도를 확인해야 합니다.

세포핵 손상

세포핵이 손상되면 DNA와 효소의 비정상적인 접촉이 증가할 수 있습니다.

이러한 문제는 배경 신호와 라이브러리 품질에 영향을 줄 수 있습니다.

12. CUT&Tag에서 필요한 대조군

CUT&Tag에서는 표적 항체가 제대로 작동했는지 확인하는 양성 대조군이 중요합니다.

예를 들어 H3K27me3처럼 비교적 풍부한 히스톤 표지를 인식하는 항체를 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다.

2020년 Kaya-Okur 연구진의 프로토콜에서는 이러한 양성 대조군을 권장했습니다.

또한 1차 항체를 제외한 음성 대조군을 이용해 비특이적 배경 신호를 평가할 수 있습니다.

대조군의 역할은 다음과 같습니다.

대조군	목적
양성 대조 항체	실험과 라이브러리 제작 과정이 작동했는지 확인
1차 항체 미첨가 대조군	비특이적 배경 신호 평가
생물학적 반복 검체	관찰된 peak의 재현성 평가
외부 표준물질	조건에 따라 정규화와 비교 분석 보조

음성 대조군에서 read가 검출됐다고 해서 실험 전체가 실패했다고 판단할 수는 없습니다.

중요한 것은 표적 항체를 사용한 검체에서 기대한 유전체 위치에 충분한 신호가 나타나는지 확인하는 것입니다.

13. CUT&Tag와 CUT&RUN은 어떤 차이가 있을까?

CUT&Tag와 CUT&RUN은 모두 항체를 이용해 특정 염색질 단백질 주변에 효소를 유도합니다.

하지만 사용하는 효소와 DNA 라이브러리 제작 과정이 다릅니다.

CUT&RUN은 일반적으로 항체에 결합한 pA-MNase를 이용해 표적 주변 DNA를 절단합니다.

절단된 DNA 조각을 회수한 뒤 별도의 라이브러리 제작 과정을 거칩니다.

반면 CUT&Tag는 pA-Tn5를 이용해 DNA를 절단하면서 시퀀싱 어댑터를 삽입합니다.

따라서 CUT&Tag에서는 DNA 절단과 어댑터 삽입이 하나의 반응으로 연결됩니다.

다만 CUT&RUN이 모든 상황에서 CUT&Tag보다 불리한 것은 아닙니다.

표적 단백질과 세포 종류, DNA 접근성 등에 따라 적합한 기술이 달라질 수 있습니다.

14. 단일세포 CUT&Tag는 무엇을 추가로 보여줄까?

일반적인 CUT&Tag에서는 여러 세포에서 얻은 DNA를 함께 분석합니다.

따라서 관찰된 히스톤 변형 패턴은 세포 집단의 평균적인 특성을 반영할 수 있습니다.

반면 단일세포 CUT&Tag는 개별 세포의 염색질 표지를 분석하도록 설계된 방법입니다.

이를 통해 서로 다른 세포 집단의 후성유전학적 차이를 연구할 수 있습니다.

예를 들어 종양 조직에는 암세포와 면역세포, 기질세포 등이 혼합돼 있을 수 있습니다.

이러한 세포들은 서로 다른 히스톤 변형 패턴을 가질 수 있습니다.

단일세포 CUT&Tag는 이러한 차이를 구별하는 데 도움이 됩니다.

그러나 단일세포에서는 분석 가능한 DNA 분자 수가 제한됩니다.

따라서 특정 유전체 위치에서 신호가 관찰되지 않았다는 사실만으로 해당 히스톤 변형이 실제로 존재하지 않는다고 단정해서는 안 됩니다.

단일세포 데이터에서는 검출 누락과 낮은 커버리지를 함께 고려해야 합니다.

15. CUT&Tag는 암 진단에 직접 사용할 수 있을까?

CUT&Tag는 암과 관련된 후성유전학적 변화를 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

예를 들어 종양세포에서 특정 유전자의 promoter에 H3K27me3가 증가했는지 분석할 수 있습니다.

또한 암세포의 전사인자 결합 위치와 활성 enhancer 관련 표지를 조사할 수 있습니다.

이러한 정보는 종양의 유전자 조절 특성을 이해하는 데 도움이 됩니다.

하지만 CUT&Tag에서 특정 히스톤 변형이 관찰됐다는 사실만으로 암을 진단할 수는 없습니다.

히스톤 변형은 세포 종류와 분화 상태, 생리적 조건에 따라 달라질 수 있기 때문입니다.

또한 임상 진단에 활용하려면 검체 처리 방법과 분석 성능, 재현성, 질환 특이성에 대한 검증이 필요합니다.

따라서 CUT&Tag는 현재 일반적인 암 확진 검사보다 후성유전학적 연구와 바이오마커 탐색에 활용되는 기술로 이해하는 것이 적절합니다.

16. CUT&Tag의 분석적 가치와 한계

CUT&Tag는 항체와 Tn5 전이효소를 결합해 특정 염색질 단백질이 존재하는 유전체 위치를 분석하는 기술입니다.

2019년 원천 연구에서는 적은 세포 수와 단일세포에서도 히스톤 변형 및 DNA 결합 단백질을 분석할 수 있음을 제시했습니다.

2020년 후속 프로토콜에서는 DNA 접근성에 의한 인공 신호를 줄이고 분석 재현성을 높이는 방법을 설명했습니다.

이러한 특징은 제한된 검체에서 후성유전학적 정보를 얻는 데 도움이 됩니다.

그러나 CUT&Tag 결과는 항체 특이성과 Tn5 반응 효율, 시퀀싱 깊이의 영향을 받습니다.

또한 특정 히스톤 변형이 존재한다는 사실만으로 해당 유전자의 발현 상태나 질환과의 인과관계를 확정할 수는 없습니다.

따라서 RNA-seq과 ATAC-seq, 기능적 유전자 분석 등과 함께 해석하는 것이 적절합니다.

CUT&Tag의 핵심적인 가치는 특정 히스톤 변형이나 DNA 결합 단백질이 존재하는 위치에서 시퀀싱 라이브러리를 직접 생성해 염색질의 조절 특성을 분석할 수 있다는 점입니다.

이러한 특성은 유전체의 염기서열 변화뿐 아니라 유전자 발현을 조절하는 후성유전학적 상태를 이해하는 데 중요한 정보를 제공합니다.

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참고문헌

1. Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, et al. (2019).

CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.

Nature Communications, 10, 1930.

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-019-09982-5

CUT&Tag 기술을 제시하고 히스톤 변형과 전사인자, 단일세포 분석 가능성을 평가한 원천 연구입니다.

2. Kaya-Okur HS, Janssens DH, Henikoff JG, Ahmad K, Henikoff S. (2020).

Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag.

Nature Protocols, 15, 3264–3283.

DOI: https://doi.org/10.1038/s41596-020-0373-x

CUT&Tag의 개선된 실험 절차와 대조군 설정, 라이브러리 품질관리 방법을 설명한 프로토콜입니다.

3. Skene PJ, Henikoff S. (2017).

An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.

eLife, 6, e21856.

DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.21856

CUT&RUN의 분석 원리와 항체 표적화 효소를 이용한 염색질 분석 방법을 제시한 연구입니다.

4. Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ. (2013).

Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.

Nature Methods, 10, 1213–1218.

DOI: https://doi.org/10.1038/nmeth.2688

Tn5 전이효소를 이용한 ATAC-seq의 원리를 제시한 연구로, CUT&Tag와의 기술적 차이를 이해하는 데 참고할 수 있습니다.

※ 본 글은 공개된 학술논문을 바탕으로 CUT&Tag의 원리와 연구 활용을 설명한 교육용 콘텐츠입니다. 특정 실험에서 보고된 세포 수와 시퀀싱 효율이 모든 항체 또는 검체에 동일하게 적용되는 것은 아닙니다.