CRISPR-Cas12와 Methylene Blue Reporter를 이용한 전기화학적 핵산 검출

CRISPR-Cas12는 형광 검출뿐 아니라 전기화학 센서와도 결합할 수 있습니다. 이번 글에서는 Cas12의 trans-cleavage와 methylene blue reporter를 이용한 전기화학적 핵산 검출 원리를 살펴보겠습니다.

CRISPR-Cas 시스템을 전기화학 센서와 연결하다

CRISPR은 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats의 약자로, Cas 단백질과 함께 특정 핵산을 인식하고 절단하는 시스템입니다.

분자진단 분야에서는 Cas9, Cas12, Cas13 등 여러 Cas protein이 연구되고 있으며 최근에는 진단 성능을 개선하기 위해 변형하거나 engineering한 Cas protein도 활용되고 있습니다.

CRISPR 기반 진단에서 가장 많이 접할 수 있는 최종 신호 방식 가운데 하나는 fluorescence detection입니다.

하지만 핵산 검출 결과를 확인하는 방법이 형광에만 한정되는 것은 아닙니다.

비색 검출이나 lateral flow assay, 전기화학적 검출과 같은 다양한 readout 방식이 활용될 수 있습니다.

이번 논문에서는 CRISPR-Cas12의 trans-cleavage activity를 electrochemical biosensor와 연결해 표적 핵산을 검출하는 방법을 제안했습니다.

현장형 분자진단에서 전기화학 센서가 주목받는 이유

논문의 저자들은 질병과 관련된 biomarker를 정확하고 빠르게 검출할 수 있는 기술의 필요성을 설명하면서 연구 배경을 제시합니다.

특히 현장에서 사용할 수 있는 분석 기술에는 높은 정확성뿐 아니라 빠른 결과 확인, 장비의 단순화, 비용과 휴대성도 중요한 요소가 될 수 있습니다.

이러한 관점에서 electrochemical sensor는 흥미로운 검출 방식입니다.

전극에서 발생하는 전기적 변화를 직접 측정할 수 있기 때문에 광학계가 필요한 fluorescence detection과는 다른 형태의 biosensor를 구성할 수 있습니다.

연구진은 여기에 CRISPR-Cas system의 높은 sequence recognition 특성을 결합했습니다.

즉, CRISPR-Cas12가 표적 핵산을 구별하고 전극이 그 결과를 전기적 신호로 읽도록 역할을 분리한 것입니다.

Cas12는 표적을 인식한 뒤 다른 ssDNA도 절단한다

이번 기술에서 핵심적으로 이용한 Cas12의 특성은 trans-cleavage activity입니다.

Cas12는 crRNA와 complex를 형성한 뒤 crRNA와 상보적인 표적 DNA를 인식할 수 있습니다.

Double-stranded DNA를 표적으로 할 때는 Cas12 종류에 따라 적절한 PAM sequence가 필요합니다.

표적 DNA가 인식되면 Cas12는 target DNA 자체를 절단하는 cis-cleavage를 수행하고 활성화된 상태가 됩니다.

이후 활성화된 Cas12는 주변에 존재하는 single-stranded DNA를 sequence와 관계없이 절단할 수 있습니다.

이것이 진단에 활용되는 trans-cleavage입니다.

따라서 실제 biosensor에서는 표적 DNA 자체를 절단한 결과보다 Cas12가 활성화된 뒤 별도로 설계된 ssDNA reporter를 얼마나 절단했는지를 측정하는 방식이 사용될 수 있습니다.

이번 연구에서는 이 reporter를 전기화학적으로 읽을 수 있도록 설계했습니다.

Gold 기반 Three-Electrode Sensor를 사용한다

연구진은 전기화학 신호를 측정하기 위해 gold-based disposable three-electrode sensor를 사용했습니다.

전기화학 측정에서는 일반적으로 working electrode, reference electrode, counter electrode로 구성된 three-electrode system을 사용할 수 있습니다.

이번 기술에서는 금으로 이루어진 electrode surface가 특히 중요합니다.

DNA reporter를 전극 표면에 안정적으로 고정해야 하기 때문입니다.

연구진은 DNA reporter 한쪽 말단에 thiol group을 도입했습니다.

Thiol은 gold surface와 강하게 결합할 수 있어 금 전극 위에 DNA나 다른 biomolecule을 고정하는 방법으로 많이 사용됩니다.

따라서

Gold Electrode – Thiol – ssDNA Reporter

형태로 reporter를 전극 표면에 연결할 수 있습니다.

하지만 DNA 자체만 고정해서는 전기화학적 신호를 측정하기 어렵습니다.

이를 위해 reporter의 반대쪽에는 methylene blue(MB)​를 결합했습니다.

Methylene Blue가 전기화학 신호를 만든다

Methylene blue는 redox-active molecule로 전극과 전자를 주고받을 수 있기 때문에 electrochemical reporter로 활용할 수 있습니다.

이번 연구에서는 하나의 ssDNA reporter에 두 가지 기능을 부여했습니다.

한쪽에는 thiol group을 넣어 gold electrode에 고정하고, 다른 쪽에는 methylene blue를 부착해 전기화학적 신호를 발생시키도록 했습니다.

구조를 단순하게 표현하면 다음과 같습니다.

Gold Electrode

→ Thiol

→ Single-Stranded DNA Reporter

→ Methylene Blue

이 reporter가 전극에 그대로 남아 있으면 MB가 electrode surface와 가까운 위치를 유지할 수 있습니다.

그 결과 전극과 methylene blue 사이의 electron transfer가 가능해 비교적 높은 electrochemical signal을 측정할 수 있습니다.

반대로 Cas12가 reporter를 절단하면 상황이 달라집니다.

표적 핵산이 존재하면 Cas12가 활성화된다

검출 반응의 첫 번째 단계에서는 Cas12와 crRNA가 complex를 형성합니다.

이후 표적 핵산이 존재하면 crRNA가 자신과 상보적인 target sequence를 인식합니다.

논문의 모식도에서는 target DNA 주변에 Cas12 인식에 필요한 PAM sequence가 위치한 것을 확인할 수 있습니다.

표적이 정확하게 인식되면 Cas12가 활성화됩니다.

Cas12는 우선 표적 DNA에 대한 cis-cleavage를 수행할 수 있고, 이후 활성화된 Cas12의 trans-cleavage activity가 나타납니다.

이때 주변에 있는 ssDNA reporter는 특정 염기서열과 관계없이 Cas12에 의해 절단될 수 있습니다.

여기에서 중요한 점은 electrochemical reporter 역시 single-stranded DNA로 만들어져 있다는 것입니다.

따라서 활성화된 Cas12가 전극 위의 reporter까지 절단할 수 있습니다.

Reporter가 절단되면 MB가 전극에서 떨어진다

Target DNA가 존재하는 조건에서는 활성화된 Cas12가 electrode surface에 연결된 ssDNA reporter를 절단합니다.

Reporter의 한쪽 끝은 thiol을 통해 gold surface에 고정되어 있지만 methylene blue는 DNA의 다른 위치에 연결되어 있습니다.

따라서 reporter가 절단되면 MB가 포함된 DNA fragment가 electrode surface에서 떨어져 나가거나 전극으로부터 멀어지게 됩니다.

그 결과 methylene blue와 electrode 사이의 electron transfer 효율이 감소합니다.

즉,

Target 존재

→ Cas12-crRNA가 Target 인식

→ Cas12 활성화

→ Trans-cleavage

→ MB-DNA Reporter 절단

→ Methylene Blue가 Electrode에서 멀어짐

→ Electrochemical Signal 감소

라는 반응이 나타납니다.

논문의 모식도에서 with target 조건에서 전기화학적 신호가 낮아지는 이유가 바로 이것입니다.

표적이 없으면 높은 전기화학 신호가 유지된다

반대로 target DNA가 존재하지 않는 경우를 생각해 볼 수 있습니다.

crRNA와 Cas12 complex는 존재하지만 인식할 수 있는 표적 핵산이 없습니다.

따라서 Cas12의 trans-cleavage activity가 활성화되지 않습니다.

전극 표면에 고정된 ssDNA reporter 역시 절단되지 않은 상태로 유지됩니다.

Methylene blue도 electrode surface와 가까운 위치에 남아 있게 됩니다.

이 경우 전극과 MB 사이의 electron transfer가 유지되기 때문에 상대적으로 높은 electrochemical signal을 얻을 수 있습니다.

즉,

No Target

→ Cas12 비활성 상태 유지

→ Reporter 절단 없음

→ MB가 Electrode 부근에 유지

→ 높은 Electrochemical Signal

이 됩니다.

따라서 이 assay는 target이 있을 때 신호가 증가하는 방식이 아니라 표적 핵산이 존재할수록 electrochemical signal이 감소하는 signal-off 방식이라고 이해할 수 있습니다.

Cis-Cleavage와 Trans-Cleavage는 역할이 다르다

이번 기술을 이해할 때 Cas12의 두 가지 cleavage activity를 구분하는 것이 중요합니다.

먼저 cis-cleavage는 Cas12-crRNA complex가 자신이 인식한 target DNA를 직접 절단하는 반응입니다.

반면 trans-cleavage는 Cas12가 표적을 인식해 활성화된 이후 주변의 ssDNA를 비특이적으로 절단하는 반응입니다.

진단 신호를 만드는 데 직접 이용되는 것은 주로 trans-cleavage입니다.

전극 표면의 MB-DNA reporter는 표적 sequence를 인식하기 위한 probe가 아닙니다.

표적 인식은 crRNA가 담당하고, MB-DNA reporter는 Cas12가 활성화됐는지를 전기화학적으로 알려주는 신호 변환 장치라고 볼 수 있습니다.

따라서 역할을 정리하면 다음과 같습니다.

crRNA → Target sequence recognition

Cas12 → Target recognition 후 trans-cleavage

ssDNA Reporter → Cas12의 절단 대상

Methylene Blue → Electrochemical signal 생성

Gold Electrode → Reporter 고정 및 전기 신호 측정

각 요소가 서로 다른 기능을 담당하면서 하나의 검출 시스템을 구성합니다.

DNA Reporter의 길이가 중요한 이유

연구진은 제안한 biosensor의 성능을 높이기 위해 여러 조건을 최적화했습니다.

그중 하나가 DNA reporter length입니다.

Reporter가 지나치게 짧거나 길면 methylene blue와 electrode 사이의 거리와 움직임이 달라질 수 있습니다.

또한 Cas12가 ssDNA reporter에 접근하고 절단하는 효율에도 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 reporter length는 단순한 DNA 설계 요소가 아니라 전기화학 신호와 Cas12 trans-cleavage가 동시에 영향을 받는 중요한 조건입니다.

연구진은 서로 다른 reporter 조건을 비교해 적절한 길이를 선정했습니다.

Magnesium 농도와 Cas12 반응시간도 최적화한다

CRISPR-Cas12 activity는 반응 환경의 영향을 받습니다.

특히 magnesium ion은 Cas12 nuclease activity와 관련된 중요한 반응 성분입니다.

Mg²⁺ 농도가 적절하지 않으면 Cas12의 target cleavage와 trans-cleavage efficiency가 낮아질 수 있습니다.

반대로 무조건 농도를 높인다고 반응이 계속 좋아지는 것도 아니기 때문에 최적 조건을 찾아야 합니다.

연구진은 magnesium concentration을 변화시키면서 electrochemical signal response를 비교했습니다.

또한 trans-cleavage reaction time도 최적화했습니다.

반응시간이 짧으면 충분한 reporter cleavage가 일어나지 않을 수 있지만 지나치게 길게 반응시킨다고 항상 분석 성능이 비례해서 향상되는 것은 아닙니다.

따라서 적절한 반응시간을 설정해 target과 no-target 사이의 signal difference를 확보하는 것이 중요합니다.

서로 다른 Cas12 조건도 비교한다

연구진은 하나의 조건만 고정해서 사용하지 않고 Cas12와 관련된 여러 조건을 비교했습니다.

Cas enzyme 종류나 반응 조건이 달라지면 trans-cleavage activity와 reporter cleavage efficiency 역시 달라질 수 있습니다.

특히 electrochemical sensor에서는 단순히 Cas12가 활성화되는 것뿐 아니라 reporter가 얼마나 효과적으로 절단되고 그 결과가 전극 신호 변화로 얼마나 크게 이어지는지가 중요합니다.

따라서 이 논문에서는 Cas12 reaction 자체와 electrochemical reporter system을 별개의 요소로 보지 않고 하나의 assay 전체를 기준으로 조건을 최적화했습니다.

이 점이 단순한 CRISPR cleavage 실험과 실제 biosensor 개발의 차이라고 볼 수 있습니다.

전체 전기화학 검출 원리를 정리하면

이번 논문의 검출 구조는 비교적 명확합니다.

Target DNA

→ crRNA와 상보적 결합

→ Cas12 Target Recognition

→ Cis-Cleavage

→ Cas12 Trans-Cleavage 활성화

→ Gold Electrode 위 ssDNA Reporter 절단

→ Methylene Blue가 Electrode에서 멀어짐

→ Electron Transfer 감소

→ Electrochemical Signal 감소

Target이 없다면 반대입니다.

No Target

→ Cas12 비활성

→ Reporter 유지

→ Methylene Blue가 Gold Electrode 부근에 존재

→ Electrochemical Signal 유지

결국 두 조건에서 나타나는 전기화학 신호의 차이를 이용해 표적 핵산을 검출하는 것입니다.

이 연구에서 흥미로운 부분

이번 논문의 가장 흥미로운 부분은 CRISPR-Cas12의 trans-cleavage를 단순한 fluorescence reporter가 아니라 electrode-bound DNA reporter와 연결했다는 점입니다.

Cas12 기반 분자진단에서는 fluorophore와 quencher가 결합된 ssDNA reporter를 많이 사용합니다.

활성화된 Cas12가 reporter를 절단하면 fluorophore와 quencher가 분리되고 fluorescence가 증가하는 방식입니다.

이번 연구에서는 그 신호 변환 원리를 전기화학적으로 바꿨습니다.

Fluorophore 대신 methylene blue를 사용하고 reporter를 thiol-gold interaction으로 electrode에 고정했습니다.

따라서 reporter가 절단되면 빛의 세기가 변하는 것이 아니라 electrode와 redox molecule 사이의 electron transfer가 변화합니다.

즉, Cas12의 생물학적인 nuclease activity를 전기적인 신호로 직접 변환하도록 설계한 것입니다.

전기화학 방식이 가지는 특징

전기화학 검출은 fluorescence detection과 다른 장점을 가질 수 있습니다.

Fluorescence를 측정하려면 excitation light source, optical filter, detector와 같은 광학 요소가 필요할 수 있습니다.

반면 electrochemical sensor는 electrode에서 발생하는 전류나 전위 변화를 직접 측정하도록 구성할 수 있습니다.

또한 disposable electrode와 소형 potentiostat를 이용하는 방식으로 발전시키면 휴대형 biosensing system으로 연결할 가능성도 있습니다.

하지만 전기화학 방식 역시 고려해야 할 요소가 많습니다.

Gold surface에 reporter가 얼마나 안정적으로 고정됐는지, electrode마다 surface density가 일정한지, nonspecific adsorption이 발생하는지 등이 실제 측정 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 CRISPR reaction의 정확성뿐 아니라 electrode surface chemistry와 reporter immobilization의 재현성도 중요한 요소입니다.

논문 리뷰를 마치며

이번 연구에서는 CRISPR-Cas12의 trans-cleavage activity를 gold-based electrochemical sensor와 연결한 핵산 검출 기술을 살펴봤습니다.

표적 DNA가 존재하면 Cas12-crRNA complex가 이를 인식하고 Cas12의 trans-cleavage가 활성화됩니다.

활성화된 Cas12는 금 전극 위에 고정된 ssDNA reporter를 절단합니다.

그 결과 reporter에 부착된 methylene blue가 electrode surface에서 멀어지고 electron transfer가 감소하면서 최종적인 electrochemical signal 역시 낮아집니다.

반대로 표적이 없다면 reporter가 그대로 유지되기 때문에 높은 전기화학 신호가 나타납니다.

특히 thiol을 이용한 gold electrode 고정, methylene blue를 이용한 redox signaling, Cas12의 sequence-specific recognition과 nonspecific trans-cleavage를 하나의 sensor 안에 연결했다는 점​이 이 연구에서 가장 흥미로운 부분입니다.

CRISPR-Cas 기반 진단에서 최종 신호를 반드시 fluorescence로만 확인할 필요는 없으며, Cas nuclease activity를 electrochemical readout으로 변환할 수 있다는 것을 보여준 연구라는 점에서 의미가 있습니다.

※ 이 글은 CRISPR-Cas12와 electrochemical biosensor를 이용한 핵산 검출 연구의 원리를 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다.