3D Nanoplasmonic Chip과 RPA를 결합한 EGFR 돌연변이 검출 기술

EGFR 돌연변이를 검출하기 위해 RPA와 3D nanoplasmonic 구조를 결합한 연구가 있습니다. 이번 글에서는 금 기반 나노구조와 multiplex assay를 이용한 EGFR mutation 검출 원리를 살펴보겠습니다.

EGFR 돌연변이를 검출하는 이유

논문에서는 먼저 표적 유전자인 Epidermal Growth Factor Receptor, 즉 EGFR에 대해 설명합니다.

EGFR은 폐암에서 중요한 biomarker로 활용되는 유전자 가운데 하나이며 환자에 따라 다양한 mutation이 발견될 수 있습니다.

대표적인 변이로는 Exon 19 deletion, Exon 20 insertion, Exon 21 point mutation 등이 있습니다.

이처럼 EGFR에는 서로 다른 형태의 mutation이 존재하기 때문에 하나의 변이만 확인하는 것보다 여러 변이를 동시에 구별할 수 있는 검출 기술이 중요합니다.

특히 폐암은 질환이 진행될수록 치료가 어려워질 수 있기 때문에 조기 진단과 함께 암의 유전적 특성을 파악하는 것도 중요합니다.

이러한 배경에서 연구진은 EGFR mutation을 높은 민감도로 검출하면서 동시에 여러 변이를 분석할 수 있는 방법을 개발하고자 했습니다.

Liquid Biopsy와 EGFR Mutation 분석

논문에서는 EGFR mutation 검출과 함께 liquid biopsy에 대해서도 설명합니다.

Liquid biopsy는 혈액과 같은 체액에 존재하는 암 관련 물질을 분석하는 방법입니다.

그중 circulating tumor DNA(ctDNA)는 종양에서 유래해 혈액으로 방출된 DNA이기 때문에 암 관련 mutation을 분석할 수 있는 중요한 표적이 됩니다.

조직에서 직접 tumor DNA를 확보하는 방식과 비교하면 혈액 기반 분석은 반복적인 검사가 가능하다는 장점이 있습니다.

하지만 ctDNA는 전체 cell-free DNA 가운데 매우 적은 비율로 존재할 수 있기 때문에 mutation을 정확하게 검출하려면 높은 분석 민감도가 필요합니다.

연구진은 이러한 낮은 농도의 EGFR mutation을 검출하기 위해 핵산 증폭과 nanoplasmonic fluorescence enhancement를 함께 이용했습니다.

기존 유전자 분석 방법에서 고려해야 할 부분

논문에서는 EGFR mutation 분석에 사용되는 기존 기술도 함께 언급합니다.

Next Generation Sequencing(NGS)은 여러 유전자와 mutation을 광범위하게 분석할 수 있다는 장점이 있습니다.

하지만 분석 과정과 장비가 복잡하고 검사 비용과 처리시간을 고려해야 할 수 있습니다.

Real-time PCR이나 droplet digital PCR 역시 특정 mutation을 분석하는 데 활용할 수 있습니다.

다만 하나의 검사에서 여러 mutation을 동시에 분석하거나 극소량의 mutant DNA를 wild-type DNA와 구별하려면 추가적인 assay 설계가 필요합니다.

연구진은 이러한 부분을 보완하기 위해 Recombinase Polymerase Amplification(RPA)​과 3D nanoplasmonic microarray를 결합했습니다.

RPA를 이용해 EGFR DNA를 증폭한다

RPA는 일정한 온도에서 DNA를 증폭할 수 있는 isothermal nucleic acid amplification 기술입니다.

PCR처럼 반복적인 thermal cycling이 필요하지 않으며 비교적 낮은 온도에서 빠르게 DNA를 증폭할 수 있습니다.

이번 연구에서는 EGFR의

• Exon 19 deletion
• Exon 20 insertion
• Exon 21 point mutation

을 동시에 분석하기 위한 multiplex RPA를 구성했습니다.

연구진은 mutation과 wild-type sequence 모두 증폭할 수 있도록 RPA primer를 설계했습니다.

즉, 처음 amplification 단계에서 mutant DNA만 선택적으로 증폭하는 것이 아니라 두 종류의 DNA가 모두 반응에 참여할 수 있도록 구성한 것입니다.

이후 단계에서 wild-type signal을 억제해 mutation-derived signal을 선택적으로 확인하는 방식입니다.

Primer와 Probe에 기능을 나눠 설계하다

이번 기술에서는 단순히 forward primer와 reverse primer만 이용하지 않습니다.

RPA 이후의 exonuclease 처리와 fluorescence detection을 고려해 각각의 oligonucleotide에 서로 다른 기능을 부여했습니다.

먼저 reverse primer의 5′ 말단에는 phosphate group을 붙였습니다.

이 표지는 이후 λ-exonuclease가 특정 strand를 선택적으로 분해할 수 있도록 하기 위한 것입니다.

Wild-type inhibitor에는 quencher가 결합되어 있어 wild-type sequence에서 발생할 수 있는 fluorescence signal을 억제하는 역할을 합니다.

Fluorescent probe에는 Cy5 fluorescent dye가 붙어 있어 최종적으로 3D nanoplasmonic chip에서 형광신호를 발생시킵니다.

Capture probe에는 biotin을 부착해 nanoplasmonic substrate에 고정할 수 있도록 구성했습니다.

따라서 각 probe는 하나의 역할이 아니라 전체 검출 시스템의 서로 다른 단계에 맞춰 설계되어 있습니다.

39°C에서 Multiplex RPA를 수행한다

본격적인 검출 반응에서는 먼저 multiplex RPA를 진행합니다.

논문에서 사용한 조건은 약 39°C에서 30분 동안 RPA reaction을 수행하는 것입니다.

이 과정에서 EGFR mutation과 wild-type DNA가 함께 증폭될 수 있습니다.

RPA 반응이 끝나면 double-stranded DNA amplicon이 생성됩니다.

하지만 이 상태 그대로는 3D nanoplasmonic chip에 고정된 capture probe와 효율적으로 hybridization하기 어렵습니다.

따라서 다음 단계에서 double-stranded RPA product를 single-stranded DNA로 변환하는 과정이 필요합니다.

λ-Exonuclease로 한쪽 DNA Strand를 제거한다

이 단계에서 사용되는 enzyme이 lambda exonuclease, λ-exonuclease​입니다.

앞서 reverse primer의 5′ 말단을 phosphorylation한 이유가 여기에서 나타납니다.

λ-exonuclease는 5′-phosphorylated double-stranded DNA strand를 우선적으로 분해할 수 있습니다.

따라서 RPA 이후 λ-exonuclease를 처리하면 phosphorylated strand가 제거되고 반대쪽 strand가 상대적으로 남게 됩니다.

즉,

Double-Stranded RPA Product

→ λ-Exonuclease 처리

→ 5′-Phosphorylated Strand 제거

→ Single-Stranded DNA 확보

과정이 진행됩니다.

이렇게 만들어진 ssDNA는 이후 nanoplasmonic chip의 capture probe 및 fluorescent probe와 hybridization할 수 있습니다.

Single-Stranded DNA를 3D Nanoplasmonic Chip에서 검출한다

λ-exonuclease 처리 후 남은 ssDNA는 미리 준비된 3D nanoplasmonic assay chip으로 이동합니다.

Chip 표면에는 EGFR 각 mutation을 분석하기 위한 capture probe가 고정되어 있습니다.

표적 ssDNA가 존재하면 이에 상보적인 capture probe와 결합합니다.

Fluorescent probe 역시 target DNA와 hybridization하면서 Cy5 fluorescence signal을 형성할 수 있습니다.

이 과정에서 3D nanoplasmonic structure가 중요한 역할을 합니다.

일반적인 평면 표면과 달리 3차원 형태로 제작된 금 기반 nanostructure는 빛과 금속 나노구조 사이의 상호작용을 강화할 수 있습니다.

그 결과 표면 가까이에 위치한 fluorophore의 fluorescence가 증강되는 Plasmon-Enhanced Fluorescence, PEF effect​를 활용할 수 있습니다.

3D Nanoplasmonic 구조가 형광을 증폭한다

논문에서는 금이 포함된 3D nanopillar 형태의 plasmonic substrate를 이용했습니다.

이러한 구조에서는 incident light와 금속 표면 사이에서 plasmonic effect가 발생할 수 있습니다.

특히 fluorescent dye가 nanoplasmonic surface와 적절한 거리에 있을 때 fluorescence intensity가 증가할 수 있습니다.

연구진은 이러한 PEF effect를 EGFR mutation 검출에 활용했습니다.

즉, Cy5 fluorescence 자체만 측정하는 것이 아니라 금 기반 3D nanostructure를 이용해 fluorescence signal을 더욱 강하게 만드는 방식입니다.

또한 PEF effect는 fluorophore와 nanoplasmonic surface 사이의 거리에 영향을 받을 수 있기 때문에 probe 구조와 RPA product의 길이 역시 중요한 설계 요소가 됩니다.

이 때문에 연구진은 효율적인 PEF signal을 얻기 위해 RPA amplicon의 길이와 probe 위치를 함께 고려했습니다.

Wild-Type Inhibitor가 정상 유전자 신호를 억제한다

이 기술에서 높은 mutation discrimination을 구현하기 위해 사용한 또 다른 요소가 wild-type inhibitor입니다.

Liquid biopsy에서는 mutant DNA보다 wild-type DNA가 훨씬 많이 존재할 수 있습니다.

따라서 정상 DNA까지 강한 fluorescence를 만들면 낮은 비율의 mutation signal을 구별하기 어려워질 수 있습니다.

이를 해결하기 위해 연구진은 wild-type sequence에 선택적으로 결합할 수 있는 inhibitor를 사용했습니다.

Wild-type inhibitor에는 quencher가 부착되어 있습니다.

Wild-type DNA가 존재하면 inhibitor가 해당 sequence와 결합하면서 fluorescent probe에서 발생할 수 있는 형광을 억제합니다.

반대로 mutation이 존재하는 DNA에서는 wild-type inhibitor가 효과적으로 결합하지 못하기 때문에 fluorescence signal이 유지될 수 있습니다.

결과적으로

Mutant DNA → 강한 Fluorescence Signal

Wild-Type DNA → Quenching으로 Signal 억제

라는 차이를 만들 수 있습니다.

PEF와 Wild-Type Inhibition을 함께 이용한다

이번 논문의 검출 원리를 이해할 때 중요한 것은 하나의 기술만으로 높은 신호 차이를 만든 것이 아니라는 점입니다.

먼저 RPA를 이용해 EGFR target DNA를 증폭합니다.

λ-exonuclease를 이용해 double-stranded amplification product를 ssDNA 형태로 바꿉니다.

이후 3D nanoplasmonic chip에 hybridization한 뒤 PEF effect를 이용해 mutation-derived fluorescence signal을 증가시킵니다.

동시에 wild-type inhibitor는 정상 sequence에서 발생하는 fluorescence를 억제합니다.

즉,

Mutation Signal은 증가시키고

Wild-Type Signal은 감소시키는

두 가지 전략을 동시에 이용한 것입니다.

이러한 구조가 낮은 비율로 존재하는 EGFR mutation을 구별하는 데 중요한 역할을 합니다.

세 가지 EGFR Mutation을 Multiplex로 구분한다

연구진은 하나의 mutation만 검출하지 않았습니다.

EGFR의 주요 변이인 Exon 19 deletion, Exon 20 insertion, Exon 21 point mutation을 동시에 분석할 수 있도록 multiplex assay chip을 제작했습니다.

3D nanoplasmonic microarray의 서로 다른 위치에 각 mutation에 대응하는 capture probe를 고정합니다.

RPA와 λ-exonuclease 반응을 거친 ssDNA가 chip에 적용되면 자신의 sequence와 일치하는 capture probe가 있는 위치에 hybridization합니다.

따라서 어떤 위치에서 fluorescence signal이 발생하는지 확인하면 어떤 EGFR mutation이 존재하는지 구별할 수 있습니다.

이것은 단순한 positive 또는 negative 판정에서 한 단계 더 나아가 하나의 chip 안에서 여러 mutation을 동시에 구별할 수 있도록 설계한 방식입니다.

전체 검출 과정을 정리하면

이번 논문의 실험은 여러 기술이 순차적으로 연결되어 있습니다.

EGFR DNA

→ Multiplex RPA

→ Double-Stranded Amplicon 생성

→ λ-Exonuclease 처리

→ Single-Stranded DNA 생성

→ 3D Nanoplasmonic Chip Hybridization

→ Capture Probe 결합

→ Cy5 Fluorescent Probe 결합

→ Wild-Type Signal Quenching

→ PEF에 의한 Mutation Signal 증강

→ EGFR Mutation 판별

RPA는 핵산 amplification을 담당하고 λ-exonuclease는 chip hybridization에 적합한 ssDNA를 만들어줍니다.

Wild-type inhibitor는 background signal을 억제하고 3D nanoplasmonic structure는 mutation에서 발생하는 fluorescence를 증강합니다.

서로 다른 원리를 가진 기술을 하나의 assay로 결합한 것이 이번 연구의 핵심입니다.

이 연구에서 주목할 부분

이번 논문에서 흥미로운 점은 단순히 RPA를 이용해 EGFR을 증폭했다는 것이 아닙니다.

RPA amplification 이후 λ-exonuclease를 이용해 원하는 strand만 남긴 다음, 이를 3D nanoplasmonic microarray에서 검출하도록 연결한 설계​가 중요한 부분입니다.

또한 mutant sequence에서 발생하는 signal을 높이는 것만 생각한 것이 아니라 wild-type inhibitor를 이용해 정상 DNA에서 발생하는 fluorescence를 억제했습니다.

여기에 gold nanoparticle 기반 3D plasmonic structure의 PEF effect를 적용해 fluorescence detection efficiency를 높였습니다.

특히 PEF effect는 fluorophore와 nanoplasmonic surface 사이의 거리에 영향을 받기 때문에 연구진이 RPA product의 길이와 probe 위치까지 고려해 assay를 최적화했다는 점도 흥미롭습니다.

최종적으로 Exon 19 deletion, Exon 20 insertion, Exon 21 mutation을 하나의 microarray에서 분석할 수 있도록 구성하면서 multiplex detection까지 구현했습니다.

3D Nanoplasmonic RPA Assay의 의미

이번 연구는 isothermal nucleic acid amplification 기술인 RPA만으로 완성된 assay가 아닙니다.

RPA의 핵산 증폭 능력, λ-exonuclease의 strand-selective digestion, wild-type inhibitor의 quenching, 3D nanoplasmonic structure의 PEF effect​가 함께 사용됐습니다.

각각의 기술이 서로 다른 문제를 해결하도록 구성한 것입니다.

RPA는 낮은 농도의 target DNA를 증가시키고, λ-exonuclease는 hybridization에 필요한 ssDNA를 준비합니다.

Wild-type inhibitor는 mutation discrimination을 높이며 nanoplasmonic substrate는 fluorescence signal을 강화합니다.

다만 λ-exonuclease 처리와 chip hybridization 과정이 추가되기 때문에 단순한 one-pot RPA와 비교하면 assay 단계가 늘어난다는 점도 고려할 필요가 있습니다.

그럼에도 등온 핵산 증폭과 3D nanoplasmonic fluorescence enhancement를 연결하고 여러 EGFR mutation을 하나의 chip에서 동시에 분석했다는 점에서 흥미로운 분자진단 연구라고 볼 수 있습니다.

※ 이 글은 3D nanoplasmonic substrate와 RPA를 이용한 EGFR mutation 검출 연구의 원리를 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다.