Exonuclease III와 EXPAR를 결합한 miRNA 검출 기술의 원리

EXPAR는 짧은 핵산을 빠르게 증폭할 수 있는 등온 핵산 증폭 기술입니다. 이번 글에서는 Exonuclease III와 EXPAR를 연결하고 G-quadruplex DNAzyme으로 miRNA를 검출한 연구를 살펴보겠습니다.

짧은 핵산 검출에 활용되는 EXPAR

EXPAR(Exponential Amplification Reaction)는 일정한 온도에서 짧은 핵산을 반복적으로 생성할 수 있는 등온 핵산 증폭 기술입니다.

대표적인 등온 증폭 기술에는 Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP), Recombinase Polymerase Amplification(RPA) 등이 있습니다.

LAMP는 여러 primer를 이용하는 복잡한 설계가 필요하고 RPA 역시 primer와 표적 sequence의 조건을 고려해야 합니다.

반면 EXPAR는 비교적 짧은 template를 이용해 반응을 구성할 수 있다는 특징이 있습니다.

특히 EXPAR에서는 nicking enzyme과 strand-displacing DNA polymerase의 반복적인 반응을 이용해 짧은 핵산을 대량으로 생성할 수 있습니다.

이러한 특징은 miRNA처럼 길이가 약 18~24 nucleotide에 불과한 짧은 핵산을 검출하는 데 활용할 수 있습니다.

긴 핵산 전체를 직접 EXPAR로 증폭하는 것은 설계에 제약이 있을 수 있지만, 짧은 miRNA는 EXPAR의 증폭 구조와 연결하기에 적합한 표적이 될 수 있습니다.

이번 논문에서도 이러한 EXPAR의 특성을 이용해 miRNA 검출 시스템을 구성했습니다.

논문이 miRNA에 주목한 이유

연구진은 먼저 표적 핵산인 microRNA(miRNA)의 특징을 설명합니다.

miRNA는 길이가 짧은 non-coding RNA로 세포 안에서 유전자 발현을 조절하는 중요한 역할을 합니다.

대표적으로 특정 messenger RNA(mRNA)에 작용해 mRNA의 분해를 유도하거나 translation을 억제함으로써 단백질 발현에 영향을 줄 수 있습니다.

또한 여러 연구를 통해 특정 miRNA의 발현 변화와 암을 포함한 다양한 질환의 관련성이 보고되면서 biomarker 후보로도 연구되고 있습니다.

원문에서 소개한 사례 가운데 하나가 miRNA-155입니다.

특정 질환에서 miRNA-155의 발현 변화를 분석해 질병 상태와의 관련성을 평가하는 연구가 진행되고 있으며, 이러한 특징 때문에 miRNA를 정확하게 측정할 수 있는 분석 기술의 필요성도 높아졌습니다.

하지만 실제 miRNA 검출에는 여러 어려움이 있습니다.

miRNA는 길이가 매우 짧고 같은 family에 속하는 sequence끼리 유사도가 높을 수 있습니다. 검체에 존재하는 양 역시 적을 수 있어 별도의 신호 증폭 없이 낮은 농도의 표적을 측정하기 어려울 수 있습니다.

따라서 miRNA 검출에서는 표적을 구별하는 과정과 함께 낮은 농도의 핵산 신호를 충분히 증폭하는 기술이 중요합니다.

PCR 대신 등온 핵산 증폭을 이용한 이유

핵산 분석에서 가장 대표적인 amplification 방법은 Polymerase Chain Reaction(PCR)입니다.

PCR은 높은 민감도로 핵산을 검출할 수 있지만 denaturation, annealing, extension을 위해 온도를 반복적으로 변화시키는 thermal cycling 과정이 필요합니다.

RNA를 대상으로 하는 경우에는 reverse transcription 과정까지 고려해야 합니다.

특히 매우 짧은 miRNA는 일반적인 genomic RNA를 분석하는 것과 다른 primer와 protocol 설계가 필요할 수 있습니다.

이 때문에 miRNA 검출에서는 PCR뿐 아니라 일정한 온도에서 반응할 수 있는 다양한 nucleic acid amplification 기술도 연구되고 있습니다.

논문에서는 이러한 방법으로 Rolling Circle Amplification(RCA), Catalytic Hairpin Assembly(CHA), EXPAR 등을 소개합니다.

그중 연구진이 선택한 것이 EXPAR입니다.

EXPAR는 빠른 증폭반응과 높은 amplification efficiency를 이용할 수 있어 짧고 농도가 낮은 miRNA를 검출하기 위한 방법으로 적용됐습니다.

Exonuclease III가 첫 번째 반응을 시작한다

이번 연구에서 EXPAR와 함께 중요한 역할을 하는 enzyme이 Exonuclease III(Exo III)​입니다.

Exo III는 double-stranded DNA의 3′ 말단에서 nucleotide를 순차적으로 제거할 수 있는 exonuclease activity를 가지고 있습니다.

연구진은 이러한 특성을 표적 miRNA의 존재를 확인하고 이후 EXPAR를 시작하는 단계에 이용했습니다.

즉, Exo III가 직접 EXPAR 증폭을 담당하는 것이 아니라 표적 miRNA가 존재했을 때 EXPAR에 사용할 수 있는 template를 만들어주는 역할을 하도록 검출 시스템을 설계했습니다.

이 부분을 이해하면 논문에서 제안한 전체 검출 원리를 훨씬 쉽게 파악할 수 있습니다.

표적 miRNA가 LT Probe와 결합한다

검출의 첫 번째 단계에는 LT probe가 사용됩니다.

표적 miRNA가 존재하면 LT probe의 1 영역과 상보적으로 결합합니다.

miRNA와 LT probe가 결합하면서 부분적인 double-stranded structure가 만들어지고, 이 구조에 Exo III가 작용합니다.

Exo III의 exonuclease activity에 의해 LT probe의 1 영역부터 2 영역까지 제거됩니다.

이 반응이 중요한 이유는 처음 상태의 LT probe와 Exo III 반응을 거친 LT probe의 역할이 다르기 때문입니다.

1과 2 영역이 제거된 LT는 이후 EXPAR template인 TS로 사용될 수 있습니다.

반면 표적 miRNA는 다시 다른 LT probe와 결합할 수 있습니다.

따라서 하나의 표적 miRNA가 새로운 LT probe와 다시 반응하면서 Exo III에 의한 template 생성 과정이 반복될 수 있습니다.

Exo III 반응이 EXPAR Template를 만들어낸다

앞 단계에서 Exo III에 의해 LT probe의 일부 영역이 제거되면 EXPAR를 수행할 수 있는 TS가 노출됩니다.

이제 이 TS에 primer가 결합합니다.

Primer가 template에 hybridization하면 DNA polymerase가 primer의 말단에서부터 새로운 DNA strand를 합성합니다.

그 결과 template와 새롭게 합성된 DNA가 결합한 double-stranded DNA 영역이 만들어집니다.

하지만 EXPAR는 여기에서 끝나지 않습니다.

새롭게 형성된 이중가닥에는 다음 증폭반응을 일으킬 수 있는 nicking enzyme recognition site가 포함되어 있습니다.

원문의 모식도에서는 노란색으로 표시된 5와 6 영역이 이 과정에 관여합니다.

Nicking Enzyme이 증폭 Cycle을 시작한다

DNA polymerase에 의해 double-stranded DNA가 만들어지면 nicking enzyme이 자신의 recognition sequence를 인식합니다.

이후 모식도에서 6 영역에 해당하는 부분이 절단됩니다.

이 절단은 DNA 전체를 두 조각으로 완전히 분리하는 것이 아니라 특정 strand에 nick을 만드는 반응입니다.

Nicking 이후 DNA polymerase는 다시 4 영역부터 DNA synthesis를 시작할 수 있습니다.

새로운 DNA가 합성되면서 기존에 결합되어 있던 4* sequence는 strand displacement에 의해 template에서 떨어져 나옵니다.

이제 하나의 짧은 4* DNA가 생성됩니다.

하지만 동일한 template에는 nicking enzyme recognition site가 다시 만들어질 수 있기 때문에 nicking과 polymerization 과정이 반복됩니다.

Nicking

→ DNA Polymerase Extension

→ Strand Displacement

→ 4 생성*

→ 다시 Nicking

이라는 cycle이 계속 이어지는 것입니다.

그 결과 짧은 시간 동안 많은 양의 4*가 생성될 수 있습니다.

이것이 EXPAR가 담당하는 핵심 amplification 과정입니다.

EXPAR에서 생성된 4*가 SP Probe와 결합한다

EXPAR를 통해 대량으로 만들어진 4* sequence는 다음 단계에서 SP probe와 결합합니다.

SP에는 4*와 상보적으로 결합할 수 있는 영역이 존재합니다.

4*가 SP와 hybridization하면 SP의 구조가 변하면서 기존에 자유롭게 기능하지 못하던 8 영역이 노출됩니다.

이 8 영역이 최종 신호 발생에서 매우 중요한 역할을 합니다.

바로 G-quadruplex를 형성할 수 있는 G-rich sequence이기 때문입니다.

따라서 이 논문에서 EXPAR의 역할은 단순히 DNA를 많이 생성하는 것으로 끝나지 않습니다.

EXPAR에서 만들어진 4*가 SP에 결합함으로써 최종적으로 peroxidase-mimicking DNAzyme을 활성화할 수 있도록 설계되어 있습니다.

G-Quadruplex와 Hemin이 최종 신호를 만든다

SP에서 노출된 8 영역은 적절한 조건에서 G-quadruplex structure를 형성할 수 있습니다.

여기에 hemin이 결합하면 peroxidase와 유사한 catalytic activity를 나타내는 G-quadruplex/hemin DNAzyme이 형성됩니다.

즉,

EXPAR Product 4*

→ SP 결합

→ 8 영역 노출

→ G-Quadruplex 형성

→ Hemin 결합

→ Peroxidase-Mimicking DNAzyme

으로 연결됩니다.

여기에서 G-quadruplex DNAzyme이 표적 miRNA를 직접 인식하는 것은 아닙니다.

표적 인식은 LT probe와 Exo III 반응에서 시작되고, EXPAR가 그 신호를 증폭한 다음 G-quadruplex/hemin DNAzyme이 증폭된 결과를 최종적으로 확인할 수 있는 신호로 바꾸는 역할을 합니다.

ABTS 산화로 miRNA를 비색 검출한다

마지막으로 G-quadruplex/hemin DNAzyme의 peroxidase-mimicking activity를 이용해 ABTS를 산화시킵니다.

ABTS가 산화되어 ABTS⁺가 만들어지면 색 변화가 발생합니다.

따라서 최종적인 colorimetric signal을 통해 앞단에서 시작된 표적 miRNA의 존재를 확인할 수 있습니다.

논문의 전체 검출 과정을 연결하면 다음과 같습니다.

Target miRNA

→ LT Probe 결합

→ Exo III 반응

→ TS 생성

→ Primer 결합

→ DNA Polymerase Extension

→ Nicking

→ Strand Displacement

→ 4 대량 생성*

→ SP 결합

→ G-Quadruplex 노출

→ Hemin 결합

→ ABTS 산화

→ 비색 신호 발생

Exo III와 EXPAR, G-quadruplex DNAzyme이 각각 다른 역할을 담당하면서 하나의 miRNA 검출 시스템을 구성하는 것입니다.

Enzyme 농도를 조절해 반응 조건을 최적화하다

이 검출 시스템에는 하나의 enzyme만 사용되는 것이 아닙니다.

초기 표적 인식 단계에서는 Exonuclease III가 필요하고, EXPAR에서는 nicking enzyme과 DNA polymerase가 사용됩니다.

따라서 각 enzyme의 농도는 전체 반응 효율에 영향을 줄 수 있습니다.

연구진은 이를 고려해 nicking enzyme, DNA polymerase, Exonuclease III 농도에 대한 최적화 실험​을 진행했습니다.

최적화된 조건에서 논문은 약 30분의 반응시간으로 1 fM 농도의 표적 miRNA를 검출하는 결과를 제시했습니다.

이는 하나의 enzyme만으로 신호를 증가시킨 것이 아니라 Exo III를 이용한 template 생성과 EXPAR의 반복적인 증폭을 연결한 결과입니다.

이 논문에서 흥미로운 부분

이번 연구의 특징은 EXPAR 하나만 이용해 miRNA를 검출한 것이 아니라는 점입니다.

먼저 표적 miRNA가 LT probe에 결합하면 Exo III가 LT의 일부 영역을 제거해 EXPAR에 사용할 수 있는 template를 만듭니다.

이후 nicking enzyme과 DNA polymerase가 반복적으로 작용하면서 많은 양의 4* sequence가 생성됩니다.

증폭된 4*는 다시 SP와 결합해 G-quadruplex 영역을 노출시키고, 여기에 hemin이 결합하면서 peroxidase-mimicking DNAzyme이 만들어집니다.

마지막에는 ABTS를 산화시켜 비색 신호로 결과를 확인합니다.

즉, 이 기술에서는

Exonuclease를 이용한 표적 반응

→ EXPAR를 이용한 핵산 증폭

→ DNAzyme을 이용한 신호 발생

이라는 서로 다른 반응이 하나의 검출법 안에 연결되어 있습니다.

특히 EXPAR가 짧은 핵산을 반복적으로 생성할 수 있다는 특성을 miRNA 검출에 적용하고, 증폭 결과를 G-quadruplex/hemin의 peroxidase-mimicking activity와 연결했다는 점이 흥미로운 부분입니다.

또한 peroxidase-mimicking DNAzyme은 최종 신호를 비색 방식으로 변환할 수 있어 핵산 증폭 결과를 확인하기 위한 다양한 biosensor 설계에 활용할 수 있습니다.

이번 논문은 짧은 miRNA라는 표적의 특성과 EXPAR의 증폭 특성을 연결하고, Exonuclease III를 이용해 EXPAR template 생성까지 제어했다는 점​에서 살펴볼 가치가 있는 분자진단 연구입니다.

※ 이 글은 Exonuclease III, EXPAR 및 peroxidase-mimicking DNAzyme을 이용한 miRNA 검출 연구를 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다.