In Situ Sequencing 원리: 조직 안에서 RNA 염기서열과 발현 위치를 함께 분석하는 방법

RNA가 어느 세포에서 발현되는지뿐 아니라 실제 염기서열까지 확인할 수 있다면 조직 분석에 새로운 정보가 추가됩니다. In Situ Sequencing(ISS)은 조직의 공간적 구조를 유지하면서 RNA에서 유래한 DNA 서열을 판독하는 기술입니다.

1. RNA의 위치와 염기서열을 함께 분석하는 이유

RNA-seq은 RNA의 종류와 발현량, 염기서열을 분석하는 대표적인 기술입니다.

그러나 조직 전체에서 RNA를 추출하면 해당 RNA가 원래 어느 세포에 존재했는지 알기 어려워집니다.

반면 RNAscope나 MERFISH 같은 형광 기반 분석법은 RNA의 위치를 보존하면서 여러 유전자의 발현을 확인할 수 있습니다.

다만 이러한 방법은 일반적으로 미리 설계한 probe와 바코드를 이용해 RNA의 종류를 구별합니다.

ISS는 여기에서 한 단계 다른 접근법을 사용합니다.

RNA에서 유래한 DNA를 조직 내부에서 증폭하고, 해당 DNA의 염기서열을 영상으로 판독하는 방법입니다.

이를 통해 특정 RNA의 존재 여부뿐 아니라 짧은 서열 정보와 조직 내 위치를 함께 얻을 수 있습니다.

2. In Situ Sequencing은 어떤 기술일까?

In Situ Sequencing은 조직이나 세포 안에서 핵산의 염기서열을 읽는 기술입니다.

일반적인 NGS에서는 핵산을 추출해 시퀀싱 장비에서 분석합니다.

반면 ISS에서는 핵산 증폭 산물이 조직 내부의 위치에 유지되도록 처리합니다.

이후 여러 차례의 형광 반응과 영상 촬영을 통해 염기를 판독합니다.

2013년 Ke와 연구진은 Nature Methods에 조직과 세포에서 RNA를 표적으로 하는 ISS 방법을 발표했습니다.

이 연구에서는 Padlock Probe와 Rolling Circle Amplification(RCA)을 이용해 RNA 유래 서열을 분석했습니다.

또한 사람 유방암 조직에서 유전자 발현과 점돌연변이를 분석할 수 있음을 제시했습니다. <Cite ref=”turn321947search1″/>

다만 ISS는 하나의 고정된 실험법만을 의미하지 않습니다.

Padlock Probe를 이용한 표적형 ISS와 보다 폭넓은 RNA 서열을 읽는 FISSEQ 등 여러 구현 방식이 존재합니다.

3. ISS에서 RNA를 직접 읽지 않고 DNA로 바꾸는 이유

RNA는 DNA보다 화학적으로 불안정하며 실험 과정에서 분해될 수 있습니다.

또한 일반적인 DNA 중합효소 기반 증폭 방법은 RNA를 그대로 주형으로 사용하지 않습니다.

따라서 많은 ISS 방법에서는 RNA를 먼저 cDNA로 역전사합니다.

cDNA는 RNA 서열에 상보적인 DNA입니다.

이후 cDNA를 표적으로 probe를 결합시키거나 원형 DNA를 생성합니다.

원형 DNA가 만들어지면 RCA를 이용해 동일한 서열을 반복 증폭할 수 있습니다.

이렇게 생성된 DNA 증폭 산물은 조직 안의 특정 위치에서 강한 형광 신호를 나타낼 수 있습니다.

따라서 ISS에서 관찰하는 형광 신호는 원래 RNA 분자 자체가 아니라 RNA에서 유래한 DNA 증폭 산물인 경우가 많습니다.

이 차이는 결과를 해석할 때 중요합니다.

4. Padlock Probe는 어떤 역할을 할까?

Padlock Probe는 표적 DNA 또는 cDNA의 인접한 두 서열에 결합하도록 설계된 선형 DNA probe입니다.

Probe의 양쪽 끝은 표적 서열에 상보적으로 결합합니다.

두 끝이 정확하게 인접한 위치에 결합하면 DNA ligase가 연결해 원형 DNA를 만들 수 있습니다.

이 원형 DNA는 RCA의 주형으로 사용됩니다.

예를 들어 특정 RNA의 cDNA에 A라는 서열이 존재한다고 가정하겠습니다.

Padlock Probe는 A 서열의 양쪽 부분에 결합하도록 설계할 수 있습니다.

정확하게 결합하고 연결 반응이 일어나면 원형 DNA가 생성됩니다.

반대로 연결 위치에 염기 불일치가 존재하면 사용한 ligase와 반응 조건에 따라 연결 효율이 감소할 수 있습니다.

이러한 특성은 특정 염기변이를 구별하는 분석에 활용할 수 있습니다.

그러나 Padlock Probe가 모든 염기 불일치를 완벽하게 구별하는 것은 아닙니다.

Probe 설계와 ligase 종류, 반응 조건에 따라 특이성이 달라집니다.

5. Rolling Circle Amplification이 필요한 이유

RCA는 원형 DNA를 주형으로 사용하는 핵산 증폭 방법입니다.

DNA 중합효소가 원형 DNA를 반복해서 복제하면 동일한 서열이 길게 연결된 DNA 산물이 생성됩니다.

이를 Rolling Circle Product(RCP)라고 합니다.

RCP에는 원형 DNA에 포함된 서열이 여러 번 반복됩니다.

따라서 형광 probe가 결합할 수 있는 위치도 많아집니다.

이러한 특징은 조직 내부에서 작은 핵산 신호를 관찰하는 데 도움이 됩니다.

특히 RNA에서 유래한 cDNA의 위치를 유지한 상태로 RCA가 진행되면 해당 RNA가 존재했던 위치 근처에서 점 형태의 신호가 나타날 수 있습니다.

다만 RCA 산물의 위치가 원래 RNA 분자의 정확한 좌표와 항상 일치하는 것은 아닙니다.

검체 고정과 역전사, 증폭 과정에서 분자가 이동하거나 위치 오차가 발생할 수 있기 때문입니다.

6. ISS의 대표적인 실험 과정

2013년 Ke 연구진이 제시한 표적형 ISS를 기준으로 분석 과정을 설명하면 다음과 같습니다.

① 조직 또는 세포를 고정해 구조를 보존합니다.

② 표적 RNA를 cDNA로 역전사합니다.

③ 표적 cDNA에 Padlock Probe를 혼성화합니다.

④ 적절하게 결합한 Padlock Probe를 연결해 원형 DNA를 생성합니다.

⑤ RCA로 원형 DNA를 증폭합니다.

⑥ 증폭 산물에 시퀀싱 반응을 수행합니다.

⑦ 형광 영상을 반복 촬영해 염기서열을 판독합니다.

⑧ 판독된 서열을 유전자 정보 및 조직 내 위치와 연결합니다.

실제 실험에서는 각 단계 사이에 세척과 효소 반응 조건의 조정이 필요합니다.

또한 ISS의 구현 방식에 따라 cDNA 처리와 원형화, 염기 판독 방법이 달라질 수 있습니다.

7. 조직 안에서 염기를 어떻게 판독할까?

ISS에서는 DNA 증폭 산물의 염기서열을 반복적인 형광 반응으로 판독합니다.

대표적인 방법 가운데 하나는 Sequencing by Ligation(SBL)입니다.

SBL에서는 DNA ligase와 형광 표지된 oligonucleotide를 이용해 특정 위치의 염기 정보를 읽습니다.

반응이 끝나면 현미경으로 형광 신호를 촬영합니다.

이후 다음 염기 위치를 판독하기 위한 반응을 진행합니다.

이러한 과정을 반복하면 하나의 RCA 산물에서 여러 자리의 서열 정보를 얻을 수 있습니다.

예를 들어 특정 위치에서 첫 번째 판독 결과가 A, 두 번째가 C, 세 번째가 G라고 가정하겠습니다.

이러한 결과를 연결하면 ACG라는 서열 정보를 구성할 수 있습니다.

다만 실제 SBL에서는 probe의 구조와 판독 주기에 따라 형광 신호가 염기 정보로 변환되는 방식이 다를 수 있습니다.

따라서 모든 ISS 방법이 형광 색상 하나를 염기 하나에 직접 대응시키는 것은 아닙니다.

8. 2013년 원천 연구에서는 무엇을 확인했을까?

Ke와 연구진은 2013년 Nature Methods에 발표한 연구에서 표적형 ISS를 이용해 조직 내부의 RNA를 분석했습니다.

연구진은 사람 유방암 조직 절편에서 ACTB와 HER2 mRNA의 일부 서열을 판독했습니다.

또한 여러 유전자의 발현을 공간적으로 분석하고 점돌연변이를 구별하는 방법을 제시했습니다.

이 연구의 중요한 의미는 RNA 발현과 서열 정보를 조직의 형태학적 정보와 연결했다는 점입니다.

예를 들어 조직에서 특정 유전자의 발현이 높은 영역을 확인하는 동시에 해당 RNA의 짧은 서열을 분석할 수 있습니다.

그러나 이 연구에서 사용한 ISS는 표적 RNA의 일부 구간을 분석하는 방법입니다.

모든 RNA의 전체 길이를 읽는 전장 전사체 시퀀싱과는 구별해야 합니다. <Cite ref=”turn321947search2″/>

9. 표적형 ISS와 FISSEQ의 차이

ISS에는 여러 기술적 접근법이 있습니다.

그 가운데 대표적인 두 가지가 표적형 ISS와 FISSEQ입니다.

비교 항목	표적형 ISS	FISSEQ
대표적인 원천 연구	Ke et al., 2013	Lee et al., 2014
분석 대상	미리 선택한 RNA 서열	보다 폭넓은 RNA 유래 서열
핵심 증폭 방식	Padlock Probe와 RCA	cDNA 원형화와 RCA
서열 판독	표적 서열 또는 바코드 판독	RNA 유래 cDNA 서열 판독
주요 장점	선택한 표적과 변이 분석에 적합	다양한 RNA의 탐색적 분석 가능
주요 제한	사전 표적 설계 필요	검출 효율과 서열 판독 편향

표적형 ISS는 특정 유전자나 변이 위치를 분석하려는 목적에 적합할 수 있습니다.

반면 FISSEQ는 더 폭넓은 RNA 서열을 탐색하도록 개발됐습니다.

하지만 FISSEQ에서도 모든 RNA가 동일한 효율로 검출되는 것은 아닙니다.

따라서 분석 목적에 따라 기술을 선택해야 합니다.

10. FISSEQ는 어떻게 RNA를 분석할까?

FISSEQ는 Fluorescent In Situ Sequencing의 약자입니다.

2014년 Lee와 연구진은 Science에 FISSEQ를 이용한 고다중 RNA 분석 방법을 발표했습니다.

이 방법에서는 고정된 세포 안에서 RNA를 cDNA로 역전사합니다.

이후 cDNA를 원형화하고 RCA를 수행해 증폭 산물을 생성합니다.

증폭 산물은 세포 내부의 위치에 유지되도록 처리합니다.

그다음 반복적인 형광 시퀀싱 반응으로 DNA 서열을 판독합니다.

이러한 방식은 특정 유전자에 대한 별도의 Padlock Probe를 각각 설계하는 표적형 ISS와 차이가 있습니다.

그러나 역전사와 원형화, RCA 과정에서 검출 효율이 달라질 수 있습니다.

따라서 FISSEQ가 모든 RNA를 빠짐없이 읽는 방법이라고 설명해서는 안 됩니다.

11. 2014년 FISSEQ 연구에서 보고한 결과

Lee와 연구진은 FISSEQ를 이용해 사람의 1차 섬유아세포에서 RNA 서열과 위치를 분석했습니다.

원천 논문에서는 약 30개 염기 길이의 read를 이용해 8,102개 유전자에서 유래한 RNA 서열을 분석했다고 보고했습니다.

연구진은 세포가 이동하는 상황을 모사한 실험에서도 RNA 발현과 위치를 비교했습니다.

또한 FN1 유전자의 대체 스플라이싱과 특정 염기변이에 관한 서열 정보를 분석했습니다.

이러한 결과는 FISSEQ가 RNA의 위치뿐 아니라 실제 서열 차이를 연구하는 데 활용될 수 있음을 보여줍니다.

다만 8,102개 유전자는 해당 실험에서 검출된 유전자 수입니다.

모든 검체에서 동일한 수의 유전자가 검출된다는 의미는 아닙니다. <Cite ref=”turn321947search4″/>

12. ISS에서 점돌연변이를 검출하는 원리

ISS는 특정 RNA의 염기서열을 판독하기 때문에 점돌연변이 분석에 활용할 수 있습니다.

예를 들어 정상 RNA 서열이 다음과 같다고 가정하겠습니다.

A-C-G-T-A

반면 변이 RNA 서열이 다음과 같다고 가정하겠습니다.

A-C-A-T-A

두 서열은 세 번째 염기가 다릅니다.

ISS에서 해당 위치의 염기를 정확하게 판독할 수 있다면 정상 서열과 변이 서열을 구별할 수 있습니다.

이러한 분석은 특정 변이 RNA가 조직의 어느 세포에서 발현되는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

그러나 RNA에서 변이 서열이 관찰됐다고 해서 해당 변이가 반드시 DNA 수준에 존재한다고 확정할 수는 없습니다.

RNA 편집이나 역전사 오류, 시퀀싱 오류 등이 영향을 줄 수 있기 때문입니다.

따라서 임상적으로 중요한 변이라면 DNA 기반 검사와의 비교가 필요할 수 있습니다.

13. ISS에서 검출되지 않은 RNA는 실제로 없는 것일까?

그렇지는 않습니다.

ISS에서 RNA가 검출되지 않는 원인은 여러 가지입니다.

첫 번째는 RNA가 실제로 존재하지 않는 경우입니다.

그러나 RNA가 존재하더라도 발현량이 매우 낮으면 검출되지 않을 수 있습니다.

두 번째는 RNA가 손상된 경우입니다.

특히 FFPE 검체에서는 RNA 분해와 고정에 따른 변형이 분석에 영향을 줄 수 있습니다.

세 번째는 역전사 효율이 낮은 경우입니다.

RNA가 충분히 존재하더라도 cDNA가 제대로 합성되지 않으면 이후 분석이 진행되지 않을 수 있습니다.

네 번째는 RCA 또는 시퀀싱 반응의 효율이 낮은 경우입니다.

따라서 ISS의 음성 결과는 RNA 품질과 효소 반응, 영상 판독 조건을 함께 고려해야 합니다.

14. ISS에서 위양성이 발생할 수 있는 이유

ISS는 염기서열을 직접 판독하지만 위양성 가능성이 존재합니다.

대표적인 원인은 다음과 같습니다.

비특이적 Probe 결합

표적형 ISS에서 Padlock Probe가 의도하지 않은 서열에 결합하면 잘못된 증폭 산물이 생성될 수 있습니다.

비특이적 연결 반응

Ligase가 염기 불일치를 완전히 구별하지 못하면 잘못된 원형 DNA가 생성될 수 있습니다.

시퀀싱 오류

형광 신호가 약하거나 배경 신호가 높으면 특정 염기를 잘못 판독할 수 있습니다.

영상 정합 오류

서로 다른 시퀀싱 회차의 영상이 정확하게 정렬되지 않으면 다른 위치의 신호가 하나의 서열로 조합될 수 있습니다.

따라서 ISS에서는 표적 특이성뿐 아니라 시퀀싱 품질과 영상 정합의 정확성도 중요합니다.

15. 가상의 ISS 데이터 해석 사례

종양 조직에서 특정 RNA의 정상 서열과 변이 서열을 분석했다고 가정하겠습니다.

분석 영역	정상 서열 신호	변이 서열 신호	해석
영역 A	80	5	정상 서열 신호 우세
영역 B	40	35	변이 서열 신호 상대적으로 증가
영역 C	10	2	전체 검출 신호가 적음

이 결과에서는 영역 B에서 변이 서열의 비율이 상대적으로 높게 나타납니다.

그러나 변이 신호가 35개 검출됐다고 해서 해당 영역의 세포 35개가 변이를 가지고 있다는 의미는 아닙니다.

하나의 세포에서 여러 RNA 분자가 검출될 수 있기 때문입니다.

또한 RNA 발현량은 세포마다 다를 수 있습니다.

따라서 변이 RNA의 비율을 DNA 수준의 변이 대립유전자 빈도와 동일하게 해석해서는 안 됩니다.

이 표는 분석 원리를 설명하기 위한 가상 사례이며 실제 임상 데이터가 아닙니다.

16. ISS와 MERFISH·seqFISH+의 차이

ISS와 MERFISH, seqFISH+는 모두 RNA의 공간적 위치를 분석할 수 있습니다.

그러나 RNA를 구별하는 방법에 차이가 있습니다.

비교 항목	ISS	MERFISH	seqFISH+
핵심 원리	RNA 유래 DNA의 염기서열 판독	오류에 강한 형광 바코드	반복 혼성화와 조합형 바코드
분석 정보	서열과 위치	RNA 종류와 위치	RNA 종류와 위치
표적 설계	구현 방식에 따라 다름	사전 probe 패널 필요	사전 probe 패널 필요
변이 분석	판독 구간에 포함되면 가능	변이 특이적 설계가 필요	변이 특이적 설계가 필요
주요 제한	짧은 read와 증폭·시퀀싱 오류	바코드 오류와 검출 누락	광학적 신호 중첩과 영상 정합

MERFISH와 seqFISH+는 미리 설계한 바코드로 RNA를 식별합니다.

반면 ISS는 RNA에서 유래한 DNA의 서열을 판독할 수 있다는 특징이 있습니다.

다만 ISS에서 읽을 수 있는 서열 길이와 정확도는 분석 방법에 따라 달라집니다.

따라서 ISS가 모든 RNA의 전체 염기서열을 읽을 수 있다는 의미는 아닙니다.

17. ISS에서 공간 정보가 중요한 이유

ISS는 RNA의 서열을 조직 내 위치와 연결할 수 있습니다.

예를 들어 종양 조직에서 특정 변이 RNA가 검출됐다고 가정하겠습니다.

일반적인 RNA-seq에서는 해당 변이 RNA가 조직 전체에서 검출됐다는 사실을 확인할 수 있습니다.

반면 ISS에서는 변이 RNA가 종양 중심부에 집중돼 있는지, 주변 조직에서 관찰되는지 분석할 수 있습니다.

또한 서로 다른 세포 집단에서 특정 RNA의 발현 위치가 어떻게 달라지는지 평가할 수 있습니다.

이러한 정보는 종양 내부의 이질성을 연구하는 데 도움이 됩니다.

그러나 변이 RNA가 특정 위치에 집중됐다는 사실만으로 해당 변이가 종양 성장의 원인이라고 확정할 수는 없습니다.

유전자 기능과 단백질 발현, 세포의 생물학적 특성을 추가로 분석해야 합니다.

18. ISS의 분자진단적 활용 가능성

ISS는 RNA의 위치와 서열을 함께 분석할 수 있기 때문에 분자병리 연구에 활용할 수 있습니다.

예를 들어 종양 조직에서 특정 유전자 변이의 공간적 분포를 조사할 수 있습니다.

또한 서로 다른 세포 집단에서 특정 RNA가 발현되는 위치를 비교할 수 있습니다.

이러한 정보는 종양의 이질성과 세포 간 관계를 이해하는 데 도움이 됩니다.

그러나 ISS에서 특정 변이 RNA가 검출됐다는 사실만으로 질환을 진단하거나 치료 반응을 예측할 수는 없습니다.

임상 검사로 활용하려면 검체 처리와 시퀀싱 정확도, 검출 한계 및 판정 기준에 대한 검증이 필요합니다.

따라서 ISS는 현재 일반적인 확진 검사보다는 공간 전사체 연구와 바이오마커 탐색에 활용되는 기술로 이해하는 것이 적절합니다.

19. ISS의 분석적 가치와 한계

ISS는 조직의 공간적 구조를 유지하면서 RNA 유래 DNA의 염기서열을 분석하는 기술입니다.

2013년 Ke 연구진은 Padlock Probe와 RCA를 이용해 조직에서 RNA의 일부 서열과 점돌연변이를 분석하는 방법을 제시했습니다.

2014년 Lee 연구진은 FISSEQ를 이용해 보다 많은 RNA 서열을 조직 내부에서 분석할 수 있음을 보여줬습니다.

이러한 기술은 RNA 발현량뿐 아니라 서열 정보와 위치를 함께 분석하는 데 도움이 됩니다.

그러나 ISS는 RNA 품질과 역전사 효율, RCA 반응, 시퀀싱 오류 및 영상 정합의 영향을 받습니다.

또한 검출된 RNA 서열이 원래 RNA 전체를 대표한다고 가정해서는 안 됩니다.

특히 짧은 read만으로는 서로 유사한 전사체나 복잡한 스플라이싱 구조를 완전히 구별하기 어려울 수 있습니다.

따라서 ISS 결과를 해석할 때는 분석 대상 구간과 검출 한계, 대조군 결과를 함께 확인해야 합니다.

ISS의 핵심적인 가치는 RNA의 염기서열 정보를 조직 내 위치와 직접 연결할 수 있다는 점입니다.

이는 유전자 발현과 변이의 공간적 분포를 연구하는 데 중요한 정보를 제공하지만, 특정 RNA 서열만으로 질환의 원인을 확정하는 기술과는 구별해야 합니다.

---

참고문헌

1. Ke R, Mignardi M, Pacureanu A, et al. (2013).

In situ sequencing for RNA analysis in preserved tissue and cells.

Nature Methods, 10, 857–860.

DOI: https://doi.org/10.1038/nmeth.2563

Padlock Probe와 RCA를 기반으로 조직 내부에서 RNA의 짧은 서열과 점돌연변이를 분석한 표적형 ISS 원천 연구입니다.

2. Lee JH, Daugharthy ER, Scheiman J, et al. (2014).

Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ.

Science, 343(6177), 1360–1363.

DOI: https://doi.org/10.1126/science.1250212

FISSEQ를 이용해 세포 내부에서 RNA 유래 cDNA의 서열과 위치를 분석한 연구입니다.

3. Lee JH, et al. (2014). 원천 연구 공개 전문.

PubMed Central: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4140943/

FISSEQ의 역전사와 cDNA 원형화, RCA, 형광 시퀀싱 및 공간적 RNA 분석 결과를 상세하게 확인할 수 있습니다.

※ 본 글은 공개된 학술논문을 바탕으로 ISS의 원리와 연구 활용을 설명한 교육용 콘텐츠입니다. 표적형 ISS와 FISSEQ는 실험 설계와 분석 범위가 다르며, 연구에서 보고된 검출 성능이 모든 검체에 동일하게 적용되는 것은 아닙니다.