분할된 Catalytic Core로 작동하는 MNAzyme의 원리와 분자 스위치 기술

핵산 효소의 catalytic core를 여러 oligonucleotide로 분리하면 각각은 활성을 잃게 됩니다. MNAzyme은 facilitator가 이 조각들을 다시 조립할 때만 촉매 활성이 나타나도록 설계한 새로운 개념의 nucleic acid enzyme입니다.

핵산은 유전정보 저장 이상의 기능을 가진다

DNA와 RNA는 생물학적 유전정보를 저장하고 전달하는 물질이지만, 분자진단과 나노기술 분야에서는 그 이상의 기능을 수행할 수 있습니다.

상보적인 염기서열 사이의 hybridization을 이용할 수 있으며, strand displacement reaction을 설계해 핵산 구조를 순차적으로 변화시킬 수도 있습니다.

특정 ligand와 선택적으로 결합하는 aptamer 역시 핵산의 구조적 특성을 이용한 대표적인 기술입니다.

여기에 한 단계 더 나아가 실제 enzyme처럼 chemical reaction을 촉진할 수 있는 핵산도 존재합니다.

이러한 물질을 catalytic nucleic acid 또는 nucleic acid enzyme이라고 합니다.

대표적으로 catalytic DNA인 DNAzyme 또는 deoxyribozyme이 있으며, catalytic RNA는 일반적으로 ribozyme이라고 부릅니다.

이번 논문에서는 이러한 nucleic acid enzyme의 catalytic structure를 새로운 방식으로 분리하고 다시 조립해 사용하는 MNAzyme을 제안했습니다.

Nucleic Acid Enzyme은 어떻게 작동할까?

DNAzyme과 ribozyme은 종류에 따라 다양한 catalytic reaction을 수행할 수 있습니다.

대표적으로 특정 phosphodiester bond를 절단하거나 핵산을 연결하는 반응 등이 있으며, 그 밖에도 여러 종류의 화학반응을 촉진하는 catalytic nucleic acid가 연구되어 왔습니다.

이러한 nucleic acid enzyme을 단순하게 나누면 크게 두 가지 기능 영역으로 생각할 수 있습니다.

하나는 실제 catalytic reaction에 관여하는 catalytic core domain입니다.

다른 하나는 반응할 substrate를 인식하고 결합하는 substrate-binding domain입니다.

Catalytic core가 적절한 3차원 구조를 형성하고 substrate가 올바른 위치에 배치되면 nucleic acid enzyme이 촉매 활성을 나타낼 수 있습니다.

이러한 특징을 이용하면 nucleic acid enzyme을 biosensor로도 활용할 수 있습니다.

Target이 존재할 때만 DNAzyme을 활성화하는 방법

진단 기술에서는 target이 없는 상태에서는 catalytic activity가 나타나지 않고, target이 존재할 때만 enzyme이 활성화되는 것이 이상적입니다.

이를 위해 여러 형태의 nucleic acid molecular switch가 연구되어 왔습니다.

예를 들어 catalytic nucleic acid를 inhibitory hairpin structure 안에 가두어 놓을 수 있습니다.

Target이 존재하지 않을 때는 hairpin 때문에 enzyme이 제대로 작동하지 않습니다.

Target이 결합하면 hairpin이 열리면서 catalytic structure가 형성되고 substrate cleavage가 가능해집니다.

또 다른 방법은 target binding을 통해 substrate와 catalytic nucleic acid 사이의 결합을 안정화하는 것입니다.

이처럼 target이 nucleic acid structure나 binding affinity를 변화시키도록 설계하면 target-dependent catalytic activity를 만들 수 있습니다.

하지만 논문의 저자들은 이러한 방식에 한 가지 문제를 제기했습니다.

완전한 Catalytic Core가 남아 있으면 Background가 생길 수 있다

Target-responsive DNAzyme을 만들더라도 catalytic core가 하나의 oligonucleotide 안에 온전하게 존재한다면 target이 없는 상태에서도 일정 수준의 residual catalytic activity가 나타날 가능성이 있습니다.

진단에서는 이러한 background activity가 문제가 될 수 있습니다.

Target이 없는데도 substrate가 일부 절단되면 signal이 발생하고 target과 blank 사이의 차이가 감소할 수 있기 때문입니다.

연구진은 이를 해결하는 보다 근본적인 방법에 주목했습니다.

Catalytic core 자체를 분리하는 것입니다.

완전한 catalytic core가 존재하지 않는다면 각각의 oligonucleotide는 독립적으로 catalytic activity를 나타내기 어렵습니다.

반대로 target이 존재할 때 분리된 core가 정확하게 조립되도록 만들면 target-dependent nucleic acid enzyme을 구현할 수 있습니다.

이 개념에서 MNAzyme이 시작됩니다.

MNAzyme은 무엇인가?

MNAzyme은 Multicomponent Nucleic Acid Enzyme을 의미합니다.

이름 그대로 하나의 연속적인 nucleic acid strand가 enzyme을 구성하는 것이 아니라 여러 개의 oligonucleotide component가 조립되어 하나의 catalytic nucleic acid enzyme을 형성합니다.

이번 논문의 대표적인 구조에서는 두 개의 oligonucleotide가 사용됩니다.

바로 Partzyme A와 Partzyme B입니다.

각 partzyme은 독립적으로 존재할 때 완전한 catalytic core를 가지고 있지 않습니다.

따라서 Partzyme A만 존재하거나 Partzyme B만 존재하는 상태에서는 완전한 MNAzyme catalytic activity가 형성되지 않습니다.

두 partzyme을 올바른 구조로 조립해주는 또 다른 핵산이 필요합니다.

논문에서는 이를 assembly facilitator라고 부릅니다.

Partzyme은 세 가지 중요한 영역으로 구성된다

논문의 schematic을 보면 각각의 partzyme에는 기능이 서로 다른 영역이 배치되어 있습니다.

중요한 부분은 크게

Sensor Arm

Partial Catalytic Core

Substrate Arm

으로 구분할 수 있습니다.

Sensor arm은 assembly facilitator를 인식하는 영역입니다.

Catalytic core 부분은 원래 하나의 nucleic acid enzyme에 존재하던 catalytic sequence를 나누어 각각의 partzyme에 배치한 영역입니다.

Substrate arm은 최종적으로 절단할 substrate와 결합하는 역할을 합니다.

따라서 Partzyme A와 Partzyme B 각각은 catalytic system을 구성하는 일부 요소만 가지고 있습니다.

두 partzyme이 적절하게 assembly되어야 비로소 완전한 catalytic structure가 형성됩니다.

Partzyme A와 B만으로는 활성화되지 않는다

Partzyme A와 Partzyme B를 단순히 같은 반응액에 넣는다고 해서 활성 MNAzyme이 자동으로 만들어지는 것은 아닙니다.

두 partzyme의 sensor arm이 서로 직접 상보적으로 결합하도록 설계된 것이 아니기 때문입니다.

따라서 두 partzyme을 서로 가까운 위치로 모아 정확한 catalytic structure를 형성하도록 하는 연결 요소가 필요합니다.

그 역할을 하는 것이 assembly facilitator입니다.

Facilitator의 한쪽 영역은 Partzyme A의 sensor arm과 상보적으로 결합합니다.

다른 영역은 Partzyme B의 sensor arm과 결합합니다.

즉,

Partzyme A

← Assembly Facilitator →

Partzyme B

와 같은 구조가 만들어집니다.

Assembly facilitator가 두 partzyme 사이에서 일종의 molecular bridge 역할을 하는 것입니다.

Assembly Facilitator가 MNAzyme을 완성한다

Assembly facilitator가 존재하면 Partzyme A와 Partzyme B의 sensor arm이 각각 facilitator의 상보적인 영역을 인식합니다.

두 partzyme이 동일한 facilitator에 결합하면서 공간적으로 가까워집니다.

이때 각각에 나뉘어 있던 catalytic core sequence가 하나의 기능적인 catalytic structure를 형성할 수 있게 됩니다.

즉,

Partzyme A + Partzyme B

상태에서는 비활성이지만,

Partzyme A + Assembly Facilitator + Partzyme B

가 되면 active MNAzyme이 형성됩니다.

이러한 구조는 target-dependent molecular switch를 만들기에 매우 적합합니다.

검출하고 싶은 target nucleic acid 자체가 assembly facilitator 역할을 하도록 설계하면 target이 존재할 때만 MNAzyme이 조립되기 때문입니다.

Assembly Facilitator를 Target으로 이용할 수 있다

MNAzyme을 biosensor 관점에서 보면 assembly facilitator가 매우 중요한 의미를 가집니다.

Facilitator sequence를 임의의 target nucleic acid에 맞게 설계할 수 있다면 특정 DNA나 RNA를 MNAzyme assembly의 trigger로 사용할 수 있습니다.

Target이 존재하지 않을 때는 Partzyme A와 Partzyme B가 서로 분리되어 있습니다.

따라서 완전한 catalytic core가 형성되지 않습니다.

반대로 target nucleic acid가 존재하면 두 partzyme의 sensor arm이 target의 서로 인접한 sequence에 결합할 수 있습니다.

그러면 target을 중심으로 Partzyme A와 Partzyme B가 조립됩니다.

그 결과 분리되어 있던 catalytic core가 재구성되면서 active MNAzyme이 만들어집니다.

따라서 target nucleic acid가 단순히 probe에 결합하는 것을 넘어 nucleic acid enzyme 자체를 조립하는 molecular trigger로 작동합니다.

Substrate Arm이 Reporter를 인식한다

MNAzyme이 조립되면 다음 단계는 substrate recognition입니다.

Partzyme A와 Partzyme B에는 각각 substrate arm이 존재합니다.

이 두 영역은 절단 대상인 substrate의 서로 다른 부분과 상보적으로 결합할 수 있도록 설계됩니다.

Substrate가 MNAzyme에 결합하면 substrate의 cleavage site가 재구성된 catalytic core 근처에 위치하게 됩니다.

이제 활성화된 MNAzyme이 substrate를 절단할 수 있습니다.

이때 substrate 자체를 signal reporter로 설계하면 catalytic reaction을 바로 검출 신호로 변환할 수 있습니다.

논문의 schematic에서도 이러한 방법이 사용됩니다.

Fluorophore와 Quencher를 이용해 절단을 측정한다

검출용 substrate에는 한쪽에 fluorophore, 다른 쪽에 quencher를 배치할 수 있습니다.

Substrate가 온전한 상태에서는 두 물질의 거리가 가까워 fluorescence가 억제됩니다.

Assembly facilitator가 없다면 Partzyme A와 Partzyme B가 active MNAzyme을 형성하지 못하기 때문에 substrate 역시 절단되지 않습니다.

따라서 낮은 fluorescence가 유지됩니다.

반대로 assembly facilitator가 존재하면 두 partzyme이 조립됩니다.

Catalytic core가 완성되고 substrate arms가 reporter substrate를 적절한 위치에 결합시킵니다.

이후 catalytic cleavage가 발생하면서 substrate가 두 조각으로 나뉩니다.

Fluorophore와 quencher 사이의 거리가 멀어지면서 fluorescence가 증가합니다.

따라서 전체 반응은

Assembly Facilitator 존재

→ Partzyme A·B 결합

→ Catalytic Core 재구성

→ Active MNAzyme 형성

→ Reporter Substrate 결합

→ Substrate Cleavage

→ Fluorophore와 Quencher 분리

→ Fluorescence 증가

로 이어집니다.

MNAzyme이 Molecular Switch로 작동하는 이유

이번 기술의 중요한 특징 가운데 하나는 MNAzyme이 분자 스위치처럼 작동한다는 점입니다.

Target이 없는 상태에서는 catalytic core 자체가 물리적으로 나뉘어 있습니다.

즉, 단순히 enzyme activity를 억제하고 있는 것이 아니라 활성 enzyme이 완전히 assembly되지 않은 OFF 상태입니다.

Facilitator가 존재하면 두 partzyme이 결합하면서 catalytic core가 형성됩니다.

이때 비로소 ON 상태로 전환됩니다.

따라서

Facilitator 없음 → MNAzyme OFF

Facilitator 존재 → MNAzyme ON

이라는 구조가 가능합니다.

이는 catalytic core를 온전하게 유지하면서 구조적으로 activity만 억제하는 방식과 중요한 차이가 있습니다.

MNAzyme에서는 활성 중심 자체가 여러 component에 나뉘어 있기 때문에 target-dependent assembly를 직접 catalytic activity와 연결할 수 있습니다.

하나의 Target이 여러 Substrate를 절단할 수 있다

MNAzyme이 단순한 hybridization probe와 다른 중요한 특징도 있습니다.

Target 또는 assembly facilitator가 MNAzyme을 활성화하면 만들어진 catalytic complex는 substrate를 절단할 수 있습니다.

한 번 substrate를 절단한 뒤에도 적절한 조건에서는 다른 substrate가 다시 결합하고 추가적인 cleavage가 일어날 수 있습니다.

따라서 하나의 assembly event가 단 한 번의 signal만 만드는 구조에 국한되지 않고 catalytic turnover를 통해 여러 substrate를 연속적으로 절단하는 signal amplification 효과를 얻을 수 있습니다.

Target nucleic acid 자체를 화학적으로 증폭하지 않더라도 catalytic reaction을 반복함으로써 검출 신호를 증가시킬 수 있다는 의미입니다.

이러한 특성이 저자들이 언급한 MNAzyme의 연속적인 molecular operation과 biosensing 활용 가능성으로 연결됩니다.

Sensor Arm과 Substrate Arm을 분리한 설계가 중요하다

MNAzyme의 또 다른 특징은 target recognition과 substrate recognition을 서로 다른 arm이 담당한다는 점입니다.

Sensor arm은 assembly facilitator 또는 target을 인식합니다.

Substrate arm은 cleavage reporter를 인식합니다.

따라서 target을 변경할 때 반드시 전체 catalytic system을 처음부터 새롭게 만들 필요는 없습니다.

Sensor arm의 sequence를 새로운 target에 맞춰 변경하면서 catalytic core와 substrate recognition 영역의 기본적인 기능을 유지하는 방식의 설계가 가능합니다.

이는 MNAzyme을 다양한 nucleic acid target을 검출하는 biosensor platform으로 확장하는 데 중요한 특징입니다.

즉,

Sensor Arm → 무엇을 검출할 것인가

Catalytic Core → 어떤 catalytic reaction을 수행할 것인가

Substrate Arm → 어떤 reporter substrate에 작용할 것인가

처럼 기능을 모듈화해서 생각할 수 있습니다.

기존 Split Nucleic Acid Enzyme과 다른 접근

Catalytic nucleic acid를 여러 component로 나누는 개념 자체가 MNAzyme 이전에 전혀 없었던 것은 아닙니다.

Ribozyme을 분리하거나 G-quadruplex 기반 catalytic structure를 여러 oligonucleotide로 구성하는 연구 등이 이미 진행되어 왔습니다.

하지만 이번 연구에서 중요한 점은 특정 nucleic acid enzyme의 알려진 구조적 domain이나 기존에 관찰된 자연적인 분할 위치에 반드시 의존하지 않았다는 것입니다.

연구진은 catalytic core sequence를 여러 위치에서 나누고 이를 서로 다른 partzyme으로 구성하는 접근을 체계적으로 검토했습니다.

그리고 assembly facilitator가 존재할 때 분리된 component가 다시 기능적인 nucleic acid enzyme으로 조립될 수 있음을 보여주었습니다.

따라서 MNAzyme은 특정 DNAzyme 하나에만 적용되는 독특한 구조라기보다 multicomponent catalytic nucleic acid를 설계하는 보다 일반적인 개념으로 제안됐다는 점이 중요합니다.

MNAzyme의 전체 작동 원리

이번 논문의 대표적인 MNAzyme biosensor를 순서대로 정리하면 다음과 같습니다.

Partzyme A + Partzyme B

→ 각각 독립적으로는 Catalytically Inactive

→ Assembly Facilitator 등장

→ Partzyme A Sensor Arm 결합

→ Partzyme B Sensor Arm 결합

→ 두 Partzyme Assembly

→ Split Catalytic Core 재구성

→ Active MNAzyme 형성

→ Substrate Arms가 Reporter Substrate 인식

→ Catalytic Cleavage

→ Fluorophore와 Quencher 분리

→ Fluorescence Signal 증가

여기에서 assembly facilitator를 특정 target nucleic acid가 담당하도록 설계하면,

Target Recognition → Enzyme Assembly → Catalytic Reaction → Signal

이라는 연결이 완성됩니다.

MNAzyme에서 가장 흥미로운 부분

이번 연구에서 특히 흥미로운 점은 기존 DNAzyme에 target recognition sequence를 단순히 추가한 것이 아니라 catalytic core 자체를 여러 component로 분할했다는 점입니다.

Partzyme A와 Partzyme B는 각각 불완전한 catalytic core를 가지고 있기 때문에 독립적으로는 제대로 된 enzyme activity를 나타내기 어렵습니다.

Target 또는 assembly facilitator가 존재해야만 두 component가 정확한 위치에 모이고 catalytic core가 재구성됩니다.

즉, target의 역할이 단순한 binding에서 끝나지 않습니다.

Target이 enzyme assembly를 결정하고, enzyme assembly가 catalytic activity를 결정하는 구조입니다.

이 때문에 MNAzyme을 단순한 nucleic acid probe가 아니라 molecular switch로 해석할 수 있습니다.

또한 sensor arm의 sequence를 변경하면 서로 다른 nucleic acid를 인식하도록 설계할 수 있고, catalytic substrate를 이용하면 하나의 target recognition event를 반복적인 cleavage signal로 연결할 수 있습니다.

이러한 modularity가 MNAzyme의 중요한 특징입니다.

MNAzyme이 보여준 새로운 Nucleic Acid Enzyme 설계

이번 논문에서는 핵산 효소를 반드시 하나의 완전한 oligonucleotide로 만들어야 한다는 관점에서 벗어났습니다.

오히려 enzyme을 의도적으로 여러 조각으로 분리해 비활성 상태로 만든 뒤 특정 molecular input이 들어왔을 때만 조립되도록 설계했습니다.

이를 통해

Recognition

Assembly

Catalysis

Signal Generation

이라는 서로 다른 기능을 하나의 nucleic acid system 안에 연결할 수 있습니다.

저자들이 MNAzyme을 biosensor뿐 아니라 molecular switch와 molecular computing 등의 분야로 확장할 가능성을 언급한 이유도 이러한 구조적 특징과 관련되어 있습니다.

입력 신호에 따라 여러 nucleic acid component가 assembly되고 그 결과 catalytic output이 발생한다면 이를 논리적인 molecular operation으로 확장할 가능성이 있기 때문입니다.

논문 리뷰를 마치며

이번 논문에서는 Mokany 연구진이 제안한 새로운 형태의 MNAzyme(Multicomponent Nucleic Acid Enzyme)을 살펴봤습니다.

기존 nucleic acid enzyme에서는 하나의 oligonucleotide 안에 catalytic core가 온전하게 존재하는 경우가 많습니다.

반면 MNAzyme에서는 catalytic core를 여러 component로 분할하고 각각을 Partzyme A와 Partzyme B에 배치합니다.

두 partzyme은 독립적으로 존재할 때는 활성 catalytic structure를 형성하지 못합니다.

하지만 각각의 sensor arm과 상보적인 assembly facilitator가 존재하면 두 partzyme이 하나의 complex로 조립됩니다.

이 과정에서 분리되어 있던 catalytic core가 재구성되고 비로소 active MNAzyme이 형성됩니다.

이후 substrate arms가 fluorophore와 quencher를 가진 reporter substrate를 결합시키고 catalytic cleavage가 일어나면 fluorescence signal을 얻을 수 있습니다.

따라서 전체 기술의 핵심은

Assembly Facilitator → Partzyme Assembly → Catalytic Core Formation → Substrate Cleavage

라는 구조에 있습니다.

특히 target nucleic acid를 assembly facilitator로 이용하면 target이 존재할 때만 nucleic acid enzyme이 만들어지는 molecular switch를 구성할 수 있습니다.

단순히 DNAzyme의 활성을 조절한 것이 아니라 완전한 catalytic enzyme을 필요한 순간에 여러 nucleic acid component로부터 조립하도록 설계했다는 점이 MNAzyme의 가장 흥미로운 특징이라고 볼 수 있습니다.

※ 이 글은 Mokany et al., Journal of the American Chemical Society 132(3), 1051–1059 (2010), DOI 10.1021/ja9076777에서 제시한 MNAzyme의 작동 원리를 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다.