Phosphorothioated Probe와 THSP 반응을 이용한 miRNA LAMP 검출 기술

miRNA는 길이가 매우 짧아 일반적인 LAMP 구조를 그대로 적용하기 어렵습니다. 이번 연구에서는 stem-loop probe와 phosphorothioated probe를 이용해 짧은 miRNA를 LAMP 증폭으로 연결했습니다.

짧은 miRNA를 LAMP로 검출하다

Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)은 일정한 온도에서 핵산을 빠르게 증폭할 수 있는 대표적인 isothermal amplification 기술입니다.

일반적인 LAMP에서는 target sequence의 여러 영역을 인식하도록 primer를 설계하고 strand-displacing DNA polymerase를 이용해 연속적인 DNA amplification을 진행합니다.

기본적인 LAMP에서는 F3, B3, FIP, BIP의 4개 primer가 사용되며, 반응속도를 높이기 위해 Loop F와 Loop B primer를 추가하면 6개의 primer를 사용할 수도 있습니다.

이러한 복잡한 primer design은 높은 specificity를 확보하는 데 도움이 되지만 miRNA처럼 길이가 매우 짧은 target을 직접 LAMP로 증폭하기에는 문제가 됩니다.

miRNA는 일반적으로 약 20 nucleotide 정도에 불과하기 때문입니다.

이번 논문에서 연구진은 이러한 문제를 해결하기 위해 stem-loop probe와 phosphorothioated hairpin probe를 이용해 짧은 miRNA를 LAMP와 유사한 amplification structure로 변환하는 방법을 제안했습니다.

miRNA가 분석하기 어려운 이유

MicroRNA(miRNA)는 약 20여 nucleotide로 구성된 짧은 non-coding RNA입니다.

특정 mRNA와 상호작용하면서 translation이나 mRNA stability 등에 영향을 주어 유전자 발현을 조절할 수 있습니다.

또한 여러 질환에서 특정 miRNA의 발현량 변화가 관찰되면서 biomarker 후보로 활발하게 연구되고 있습니다.

하지만 miRNA를 정확하게 측정하는 것은 간단하지 않습니다.

먼저 길이가 매우 짧습니다.

또한 같은 miRNA family에 속하는 sequence 사이에는 한두 개의 nucleotide만 다른 경우도 있어 서로 구별하기 어려울 수 있습니다.

시료에 존재하는 양이 적은 경우에는 높은 analytical sensitivity도 요구됩니다.

따라서 짧은 target을 구별하면서 동시에 충분한 amplification을 확보할 수 있는 방법이 필요합니다.

기존 miRNA 검출법과 등온 핵산 증폭

miRNA를 정량하는 대표적인 방법 가운데 하나가 qRT-PCR입니다.

qRT-PCR은 높은 민감도로 miRNA를 분석할 수 있지만 짧은 miRNA를 reverse transcription과 PCR에 연결하기 위해 별도의 primer design이 필요합니다.

또한 thermal cycling과 fluorescence measurement가 가능한 장비가 필요하기 때문에 단순한 현장형 분석 시스템으로 구성하려면 고려해야 할 부분이 있습니다.

이러한 이유로 miRNA 검출에는 다양한 isothermal amplification 방법도 연구되어 왔습니다.

Rolling Circle Amplification(RCA), Strand Displacement Amplification(SDA), Hybridization Chain Reaction(HCR) 등이 그 예입니다.

이번 논문의 연구진은 이 가운데 LAMP에서 사용되는 dumbbell-shaped amplicon과 inner primer의 원리에 주목했습니다.

그리고 이를 그대로 적용하기보다 miRNA에 적합하도록 새로운 형태로 변형했습니다.

일반적인 LAMP를 miRNA에 적용하기 어려운 이유

LAMP에서는 하나의 target 안에서 여러 primer가 서로 다른 sequence를 인식해야 합니다.

FIP와 BIP 같은 inner primer는 각각 두 영역을 포함하며, 외부 primer와 함께 복잡한 amplification structure를 형성합니다.

하지만 약 20 nucleotide 정도에 불과한 miRNA에는 이러한 여러 primer recognition region을 직접 배치하기 어렵습니다.

따라서 이번 연구에서는 miRNA 자체를 LAMP template로 직접 사용하는 방식에서 벗어났습니다.

먼저 짧은 miRNA 정보를 stem-loop structure를 가진 더 긴 DNA product로 변환한 뒤, 이 구조를 amplification에 이용했습니다.

이 과정에서 중요한 것이 stem-loop(SL) probe와 PS hairpin(PS-H) probe입니다.

첫 번째 단계는 Stem-Loop Probe를 이용한 Reverse Transcription

반응은 target miRNA가 stem-loop probe와 결합하면서 시작됩니다.

Stem-loop 구조는 miRNA reverse transcription에서도 활용할 수 있는 형태로, 짧은 miRNA의 특정 sequence를 인식하면서 reverse transcription을 위한 구조를 제공할 수 있습니다.

Target miRNA가 SL probe와 결합하면 reverse transcription reaction이 진행됩니다.

그 결과 miRNA sequence에 대응하는 DNA 영역을 포함한 product가 만들어집니다.

이 단계의 중요한 역할은 약 20 nucleotide 정도에 불과한 miRNA 정보를 이후 amplification이 가능한 DNA 구조로 전환하는 것입니다.

따라서 연구진은 LAMP primer를 miRNA에 직접 여러 개 결합시키는 대신 reverse transcription을 이용해 target information을 더 긴 DNA reaction system으로 전달했습니다.

두 번째 Stem-Loop Probe인 PS-H가 결합한다

Reverse transcription으로 만들어진 DNA product는 다음 단계에서 PS-H probe와 상호작용합니다.

PS-H는 phosphorothioate modification이 포함된 또 다른 stem-loop 형태의 probe입니다.

앞 단계에서 생성된 sequence와 PS-H의 3′ 말단 영역이 결합하면서 DNA synthesis를 진행할 수 있는 구조가 만들어집니다.

이후 polymerase reaction이 진행되면서 양쪽 끝에 loop를 가질 수 있는 구조로 전환됩니다.

결과적으로 일반적인 LAMP에서 중요한 초기 구조인 dumbbell-shaped DNA와 유사한 amplification substrate가 만들어집니다.

논문의 저자들이 이 방법을 LAMP와 연결한 중요한 이유가 바로 여기에 있습니다.

짧은 miRNA 자체에서 LAMP를 시작하는 것이 아니라 두 종류의 stem-loop probe를 이용해 LAMP amplification이 진행될 수 있는 구조를 먼저 만들어주는 것입니다.

Phosphorothioate Modification이 중요한 이유

이번 논문의 제목에도 등장하는 핵심 요소가 Phosphorothioate(PS) modification입니다.

일반적인 DNA backbone에서는 phosphate group이 nucleotide 사이를 연결합니다.

Phosphorothioate modification에서는 phosphate에 존재하는 non-bridging oxygen 가운데 하나가 sulfur로 치환됩니다.

PS modification은 핵산 연구에서 다양한 목적으로 활용됩니다.

대표적으로 특정 nuclease에 대한 oligonucleotide의 안정성을 증가시키기 위해 사용할 수 있습니다.

하지만 이번 논문에서 PS modification을 이해할 때 nuclease resistance에만 초점을 맞추면 핵심을 놓치게 됩니다.

연구진은 PS modification을 DNA folding과 subsequent extension을 조절하기 위한 요소로 이용했습니다.

논문에서도 PS modification을 도입함으로써 self-folding efficiency를 향상시킨 것이 핵심적인 특징으로 제시됩니다.

PS Modification이 Hairpin 형성에 영향을 준다

PS-H를 이용한 반응이 진행되면 DNA synthesis에 의해 이중가닥 영역이 만들어집니다.

하지만 다음 amplification을 시작하려면 생성된 DNA가 계속 안정적인 완전 이중가닥 상태로만 존재해서는 안 됩니다.

특정 영역이 분리되고 다시 내부적으로 접혀 terminal hairpin을 형성할 수 있어야 합니다.

여기에서 PS-modified region이 중요한 역할을 합니다.

연구진은 phosphorothioate modification을 이용해 해당 duplex의 안정성과 folding behavior를 조절했습니다.

그 결과 PS가 도입된 영역의 strand separation과 subsequent self-folding이 유리해지고, 새롭게 노출된 DNA가 스스로 접히면서 hairpin structure를 형성할 수 있습니다.

즉, PS modification은 이번 연구에서 단순한 보호 modification이 아니라 DNA가 원하는 구조로 재배열되도록 유도하는 기능적인 설계 요소입니다.

THSP 반응이 시작된다

연구진은 이러한 반응을 Terminal Hairpin Formation and Self-Priming(THSP)이라고 명명했습니다.

이 이름 자체가 이번 기술의 핵심을 잘 보여줍니다.

먼저 DNA 말단에서 hairpin structure가 형성됩니다.

Terminal Hairpin Formation

이후 만들어진 hairpin의 3′ end가 별도의 외부 primer 없이 DNA synthesis를 시작할 수 있는 구조를 제공합니다.

Self-Priming

DNA polymerase가 이 3′ end를 이용해 extension을 진행하면 새로운 DNA strand가 만들어집니다.

즉,

PS Modification

→ Strand Separation/Folding

→ Terminal Hairpin Formation

→ Self-Priming

→ DNA Extension

이라는 반응이 가능해집니다.

이 THSP reaction이 일반적인 LAMP를 짧은 miRNA 검출에 맞게 변형한 이번 논문의 중요한 novelty입니다.

Self-Priming을 이용해 증폭 가능한 구조를 만든다

일반적인 핵산 증폭에서는 새로운 DNA synthesis를 시작하기 위해 별도의 primer가 필요합니다.

하지만 이번 반응에서는 DNA 자체가 terminal hairpin으로 접히면서 3′ end가 self-priming에 참여할 수 있도록 설계했습니다.

따라서 PS modification으로 folding efficiency를 조절하는 것이 전체 amplification efficiency와 연결됩니다.

논문의 저자들도 이 방법을 dumbbell-shaped amplicon과 conventional LAMP의 inner primer에서 영감을 얻은 반응으로 설명합니다.

즉, 기존 LAMP의 구조적 특징은 유지하면서 짧은 miRNA를 직접 여러 LAMP primer로 인식해야 하는 문제를 피한 것입니다.

이후 LAMP 형태의 Amplification으로 연결된다

THSP를 통해 적절한 hairpin과 self-priming structure가 만들어지면 DNA polymerase에 의한 extension과 strand displacement가 이어질 수 있습니다.

원문에서 설명한 FIP와 BIP 역시 이후 amplification을 지속시키는 중요한 요소입니다.

생성된 DNA가 다시 hairpin structure를 형성하고 새로운 extension이 시작되면서 LAMP와 유사한 반복적인 amplification이 진행됩니다.

따라서 전체 기술을 단순히

miRNA → LAMP

라고 이해하기보다는,

miRNA

→ Stem-Loop Probe Recognition

→ Reverse Transcription

→ PS-H Probe

→ Terminal Hairpin Formation

→ Self-Priming

→ LAMP-type Amplification

으로 이해하는 것이 이번 논문의 특징을 더 잘 보여줍니다.

최종 검출에는 Sequence-Specific Probe를 이용한다

DNA amplification이 많이 일어났다는 사실만으로 target-specific signal을 얻는 것은 아닙니다.

이번 연구에서는 최종적으로 생성된 amplification product를 확인하기 위해 sequence-specific detection probe를 사용했습니다.

이는 비특이적인 amplification에서 발생할 수 있는 background signal을 줄이는 데 중요한 역할을 합니다.

연구진이 사용한 검출 방식에서는 OSD probe와 amplification product의 특정 loop sequence 사이의 결합이 이용됩니다.

OSD는 oligonucleotide strand displacement를 이용하는 sequence-specific probe 형태로 이해할 수 있습니다.

Probe 내부에서는 fluorescent strand와 quencher가 관여하는 구조 때문에 초기 fluorescence가 억제됩니다.

Toehold-Mediated Strand Displacement로 형광을 발생시킨다

Target에 의해 올바른 amplification product가 만들어지면 product의 loop 영역이 OSD probe와 상호작용할 수 있습니다.

먼저 노출된 toehold sequence를 통해 결합이 시작됩니다.

이후 더 긴 상보적 sequence를 따라 strand displacement가 진행됩니다.

이를 Toehold-Mediated Strand Displacement(TMSD)라고 합니다.

그 결과 기존에 fluorescence를 억제하고 있던 probe structure가 변화하고 fluorophore와 quencher의 관계가 달라지면서 fluorescence signal을 얻을 수 있습니다.

따라서 단순히 DNA 양이 증가했다고 형광이 발생하는 것이 아니라 정해진 sequence를 가진 amplification product가 생성됐을 때 OSD probe가 반응하도록 설계한 것입니다.

이는 background noise를 줄이고 sequence specificity를 확보하는 데 중요한 부분입니다.

전체 검출 과정을 정리하면

이번 논문의 반응은 여러 단계가 연결되어 있기 때문에 전체 과정을 한 번에 보면 이해하기 쉽습니다.

Target miRNA

→ Stem-Loop(SL) Probe 결합

→ Reverse Transcription

→ PS-H Probe 3′ 영역과 결합

→ DNA Extension

→ Dumbbell-like Structure 생성

→ PS Modification에 의한 Folding 조절

→ Terminal Hairpin Formation

→ Self-Priming

→ DNA Polymerase Extension

→ LAMP-type Amplification

→ Loop Sequence 생성

→ OSD Probe Recognition

→ Toehold-Mediated Strand Displacement

→ Fluorescence Signal

이렇게 보면 phosphorothioated probe가 단순히 LAMP 반응에 첨가된 보조물질이 아니라는 것을 알 수 있습니다.

PS modification이 terminal hairpin formation과 self-priming을 가능하게 하는 구조적 설계에 관여하면서 짧은 miRNA를 LAMP amplification으로 연결합니다.

기존 LAMP와 다른 점

이번 기술은 전형적인 LAMP assay와 동일하지 않습니다.

일반적인 LAMP에서는 target DNA에 여러 primer recognition site가 존재하고 FIP, BIP, F3, B3 등이 이를 직접 인식하면서 dumbbell structure를 형성합니다.

Loop primer를 추가하면 amplification을 더욱 빠르게 진행할 수도 있습니다.

하지만 약 20 nucleotide의 miRNA에서는 이런 복잡한 primer recognition region을 확보하기 어렵습니다.

연구진은 이 문제를 target 자체에서 LAMP structure를 모두 찾는 방식이 아니라 외부에서 설계한 stem-loop probe를 이용해 필요한 구조를 인위적으로 만들어주는 방식으로 해결했습니다.

따라서 miRNA의 짧은 길이라는 물리적인 제약을 probe engineering으로 극복한 셈입니다.

PS Modification이 이 논문에서 갖는 의미

이번 논문을 읽으면서 특히 주목할 부분은 phosphorothioate modification의 사용 목적입니다.

PS modification이라고 하면 흔히 oligonucleotide를 nuclease degradation으로부터 보호하는 기능을 먼저 떠올릴 수 있습니다.

하지만 동일한 chemical modification이라도 어떻게 배치하고 어떤 구조에 적용하느냐에 따라 다른 목적으로 사용할 수 있습니다.

이번 연구에서는 PS modification을 통해 DNA의 folding behavior를 조절하고 terminal hairpin formation과 self-priming efficiency를 높이는 방향으로 활용했습니다.

즉,

Chemical Modification

→ Nucleic Acid Structure 변화

→ Self-Folding

→ Self-Priming

→ Amplification

으로 이어지는 설계입니다.

이 점에서 PS modification은 단순히 probe의 안정성을 높이는 요소가 아니라 이번 assay의 amplification mechanism을 구현하는 핵심 요소라고 볼 수 있습니다.

짧은 miRNA를 LAMP로 검출할 수 있었던 이유

처음으로 돌아가면 이번 연구의 가장 중요한 질문은 하나입니다.

길이가 약 20 nucleotide에 불과한 miRNA를 어떻게 LAMP로 증폭할 수 있었을까?

연구진은 miRNA 자체에 기존 LAMP의 여러 primer를 억지로 배치하지 않았습니다.

먼저 stem-loop probe와 reverse transcription을 이용해 짧은 miRNA 정보를 더 긴 DNA 구조로 변환했습니다.

이후 PS-H probe를 연결하고 phosphorothioate modification을 이용해 DNA folding을 조절했습니다.

그 결과 terminal hairpin이 만들어지고 DNA가 스스로 primer 역할을 할 수 있는 THSP reaction이 가능해졌습니다.

이 구조를 다시 LAMP-type amplification으로 연결함으로써 짧은 miRNA라는 한계를 극복했습니다.

따라서 이 논문의 핵심은 단순히 LAMP로 miRNA를 검출했다는 결과보다,

Stem-Loop Probe + Reverse Transcription + PS Modification + THSP + LAMP

를 하나의 시스템으로 연결했다는 설계에 있습니다.

논문 리뷰를 마치며

이번 연구에서는 phosphorothioated probe를 이용한 reverse transcription 기반 LAMP 방식으로 짧은 miRNA를 검출하는 기술을 살펴봤습니다.

miRNA는 길이가 매우 짧기 때문에 일반적인 LAMP에서 요구되는 여러 primer binding region을 직접 확보하기 어렵습니다.

연구진은 이를 해결하기 위해 두 종류의 stem-loop probe를 설계했습니다.

먼저 target miRNA와 SL probe의 결합을 이용해 reverse transcription을 진행하고, 생성된 DNA를 PS-H probe와 연결했습니다.

특히 PS modification을 이용해 DNA folding을 조절함으로써 terminal hairpin을 형성하고 self-priming이 가능하도록 만들었습니다.

연구진이 THSP(Terminal Hairpin Formation and Self-Priming)라고 명명한 이 반응은 이번 기술을 일반적인 LAMP와 구별하는 핵심적인 요소입니다.

최종적으로 생성된 amplification product는 OSD probe와의 sequence-specific strand displacement를 통해 fluorescence signal로 확인할 수 있습니다.

결국 이 연구는 약 20 nucleotide에 불과한 miRNA에 기존 LAMP 구조를 그대로 적용한 것이 아니라 probe의 구조와 phosphorothioate modification을 이용해 LAMP가 작동할 수 있는 새로운 amplification substrate를 만들어냈다는 점에서 의미가 있습니다.

특히 phosphorothioate를 단순한 nuclease-resistant modification이 아니라 핵산의 folding과 self-priming을 제어하는 요소로 활용했다는 점에서 흥미로운 분자진단 연구라고 볼 수 있습니다.

※ 이 글은 phosphorothioated probe와 reverse transcription 기반 LAMP를 이용한 miRNA 검출 연구를 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다.