Asymmetric RPA 기반 PAM-Free CRISPR-Cas12 핵산 검출 원리

CRISPR-Cas12는 dsDNA를 인식할 때 PAM 서열의 제약을 받습니다. 이번 연구에서는 asymmetric RPA로 ssDNA를 생성해 PAM 없이 Cas12를 활성화하는 새로운 검출 방법을 제안했습니다.

CRISPR-Cas12 진단에서 핵산 증폭이 필요한 이유

CRISPR-Cas system은 특정 염기서열을 선택적으로 인식할 수 있다는 특징 때문에 분자진단 분야에서도 다양하게 활용되고 있습니다.

그중 CRISPR-Cas12는 crRNA와 상보적인 target DNA를 인식한 이후 주변에 존재하는 single-stranded DNA를 비특이적으로 절단하는 collateral cleavage activity를 나타냅니다.

이러한 특성을 이용하면 표적 DNA의 존재 여부를 형광과 같은 신호로 변환할 수 있습니다.

하지만 검체에 존재하는 target DNA 농도가 매우 낮다면 CRISPR-Cas reaction만으로 충분한 검출 성능을 얻기 어려울 수 있습니다.

이 때문에 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 비롯해 Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP), Recombinase Polymerase Amplification(RPA) 등의 핵산 증폭 기술이 CRISPR 기반 진단과 결합되어 연구되고 있습니다.

특히 RPA는 일정한 온도에서 비교적 빠르게 DNA를 증폭할 수 있기 때문에 CRISPR-Cas 기반 검출과 연결하기에 유용한 기술입니다.

Double-Stranded DNA를 검출할 때 발생하는 PAM 제한

PCR, LAMP, RPA를 이용하면 많은 양의 DNA amplification product를 만들 수 있습니다.

그러나 이들 기술을 Cas12와 결합할 때 고려해야 하는 부분이 있습니다.

일반적으로 Cas12가 double-stranded DNA를 표적으로 인식하기 위해서는 target 부근에 해당 Cas12가 인식할 수 있는 PAM(Protospacer Adjacent Motif) sequence가 필요합니다.

따라서 원하는 target sequence가 존재하더라도 적절한 위치에 PAM이 없다면 Cas12를 이용한 dsDNA recognition이 제한될 수 있습니다.

특히 특정 mutation이나 매우 제한된 유전자 영역을 분석해야 한다면 PAM을 기준으로 crRNA의 위치를 자유롭게 변경하기 어려울 수도 있습니다.

저자들은 이러한 PAM dependency를 기존 CRISPR-Cas12 진단 기술에서 해결해야 할 문제 가운데 하나로 보았습니다.

Single-Stranded DNA에 주목한 이유

Cas12의 target recognition 특성을 살펴보면 문제를 해결할 수 있는 단서가 있습니다.

Cas12는 dsDNA뿐 아니라 ssDNA도 표적으로 인식할 수 있습니다.

특히 ssDNA target recognition에서는 dsDNA에서와 같은 PAM requirement에 의존하지 않고 Cas12를 활성화할 수 있습니다.

그렇다면 증폭된 DNA를 충분한 양의 single-stranded form으로 만들어준다면 PAM이 없는 sequence도 검출할 가능성이 생깁니다.

하지만 일반적인 PCR, LAMP, symmetric RPA에서는 주요 amplification product로 dsDNA가 생성됩니다.

저자들은 이러한 차이를 해결하기 위해 일반적인 RPA가 아니라 Asymmetric RPA를 사용했습니다.

Two-Step CRISPR Assay에서 제기된 문제

논문에서는 기존 CRISPR-Cas 기반 nucleic acid detection의 반응 구성에 대해서도 문제를 제시합니다.

일반적인 방법은 크게 두 단계로 나눌 수 있습니다.

먼저 target nucleic acid를 PCR이나 isothermal amplification으로 증폭합니다.

증폭이 끝난 다음 생성물을 Cas protein과 crRNA가 포함된 detection reaction에 적용합니다.

즉,

Target Amplification

→ CRISPR-Cas Detection

이라는 두 단계가 순차적으로 진행됩니다.

이 방법은 각각의 반응 조건을 독립적으로 설정할 수 있다는 장점이 있지만 assay 과정이 늘어납니다.

특히 amplification이 완료된 reaction tube를 열어 증폭산물을 다음 반응으로 옮겨야 한다면 고농도의 amplicon이 주변으로 확산되면서 carryover contamination이 발생할 가능성도 고려해야 합니다.

따라서 amplification과 CRISPR detection을 하나의 반응으로 통합하려는 연구가 이루어져 왔습니다.

RPA와 Cas12를 동시에 반응시키면 생기는 문제

RPA와 Cas12를 하나의 tube에서 동시에 반응시키면 과정은 간단해질 수 있지만 두 반응이 서로 영향을 줄 가능성이 있습니다.

RPA는 target DNA를 계속 증폭해야 합니다.

반면 Cas12-crRNA complex는 자신이 인식할 수 있는 target DNA가 생성되면 이에 결합하고 cleavage activity를 나타냅니다.

저자들은 특히 crRNA와 PAM을 기반으로 한 Cas12의 빠른 target recognition 및 cleavage가 RPA amplification과 경쟁하면서 전체 증폭 효율을 떨어뜨릴 가능성을 제시했습니다.

즉, 같은 반응 안에서

RPA는 DNA를 계속 증폭하려 하고

Cas12는 생성된 target DNA를 인식하고 절단하려 하는

상반된 반응이 동시에 발생할 수 있다는 것입니다.

연구진은 이 문제와 PAM dependency를 함께 해결하기 위한 방법으로 asymmetric amplification을 선택했습니다.

Asymmetric RPA는 Primer 농도부터 다르다

일반적인 symmetric RPA에서는 forward primer와 reverse primer를 충분한 농도로 넣어 양쪽 방향의 DNA synthesis가 계속 진행되도록 합니다.

그 결과 dsDNA가 빠르게 증가합니다.

Asymmetric RPA는 두 primer의 농도를 동일하게 사용하지 않습니다.

한쪽 primer는 높은 농도로 넣고 반대쪽 primer는 매우 낮은 농도로 제한합니다.

반응 초기에는 두 종류의 primer가 모두 존재하기 때문에 일반적인 RPA처럼 dsDNA amplification이 진행됩니다.

하지만 제한된 양으로 넣은 primer는 반응이 진행되면서 점차 소모됩니다.

이후에도 과량으로 넣은 primer는 충분히 남아 있기 때문에 해당 primer를 이용한 DNA synthesis는 계속될 수 있습니다.

그 결과 반응 후반으로 갈수록 특정 방향의 ssDNA가 상대적으로 많이 축적되는 구조가 만들어집니다.

초기 Symmetric 단계가 Asymmetric 단계로 전환된다

논문의 모식도를 보면 Asy-RPA의 특징을 조금 더 구체적으로 이해할 수 있습니다.

처음에는 double-stranded target DNA에 두 종류의 RPA primer가 결합합니다.

이 시점에서는 forward와 reverse primer가 모두 존재하므로 양쪽 방향으로 amplification이 일어날 수 있습니다.

따라서 초기에는 dsDNA가 생성됩니다.

하지만 낮은 농도로 첨가된 limiting primer가 소모되면 양쪽 primer를 이용하는 exponential amplification을 동일하게 지속하기 어려워집니다.

이후 과량으로 존재하는 excess primer를 이용한 DNA synthesis가 상대적으로 우세해지면서 특정 ssDNA product가 축적됩니다.

즉,

Target dsDNA

→ 초기 Symmetric RPA

→ dsDNA 생성

→ Limiting Primer 소진

→ Excess Primer 중심의 DNA Synthesis

→ ssDNA 축적

이라는 과정으로 반응 특성이 변합니다.

생성된 ssDNA가 PAM-Free Cas12 반응을 시작한다

Asy-RPA에서 만들어진 ssDNA는 단순한 amplification product가 아닙니다.

이 ssDNA가 바로 Cas12-crRNA complex의 target이 됩니다.

crRNA와 상보적인 ssDNA가 충분하게 생성되면 Cas12가 이를 인식하면서 활성화됩니다.

여기에서 이번 기술의 핵심적인 특징이 나타납니다.

Cas12가 dsDNA를 인식하는 경우와 달리 ssDNA target을 인식할 때는 동일한 PAM requirement가 필요하지 않습니다.

따라서 적절한 PAM이 없는 target이라도 Asy-RPA를 이용해 ssDNA 형태로 증폭하면 Cas12를 활성화할 수 있습니다.

저자들은 결국 증폭산물의 양뿐 아니라 형태를 바꿈으로써 Cas12의 PAM dependency를 우회한 것입니다.

Collateral Cleavage를 형광 신호로 바꾼다

Asy-RPA product가 Cas12-crRNA complex에 의해 인식되면 Cas12의 collateral cleavage activity가 활성화됩니다.

이때 반응액에는 별도의 short ssDNA reporter가 포함되어 있습니다.

Reporter의 한쪽에는 fluorescent molecule을 부착하고 반대쪽에는 quencher를 연결합니다.

절단되지 않은 reporter에서는 fluorophore와 quencher가 가까이 위치하기 때문에 fluorescence가 억제됩니다.

하지만 target ssDNA에 의해 Cas12가 활성화되면 주변의 reporter가 비특이적으로 절단됩니다.

Reporter가 잘리면서 fluorophore와 quencher 사이의 거리가 멀어지고 fluorescence signal이 증가합니다.

따라서 전체 검출 과정은

Asy-RPA

→ ssDNA Target 생성

→ Cas12-crRNA Recognition

→ Collateral Cleavage

→ ssDNA Reporter 절단

→ Fluorescence 증가

로 연결됩니다.

Primer 비율에 따라 ssDNA 생성량을 비교하다

Asymmetric RPA의 성능을 결정하는 중요한 요소는 두 primer 사이의 concentration ratio입니다.

농도 차이가 너무 작으면 limiting primer가 충분히 빨리 소모되지 않아 일반적인 symmetric amplification과 큰 차이가 나타나지 않을 수 있습니다.

연구진은 이를 확인하기 위해 여러 primer ratio를 설정해 실험했습니다.

가장 낮은 1:1 조건부터 최대 320:1 조건까지 총 8가지 조건을 비교했습니다.

논문의 그림 A에서는 amplification product를 agarose gel electrophoresis로 분석했습니다.

DNA는 phosphate backbone으로 인해 음전하를 띠기 때문에 전기장을 가하면 양극 방향으로 이동합니다.

Agarose gel에서는 DNA의 크기와 구조 등에 따라 이동 정도가 달라지기 때문에 생성된 amplification product를 확인할 수 있습니다.

160:1과 320:1에서 ssDNA가 뚜렷하게 나타나다

Primer ratio를 1:1로 설정했을 때는 symmetric RPA에 가까운 반응이 진행됩니다.

논문의 결과에서도 이 조건에서는 연구진이 원하는 ssDNA 생성이 뚜렷하지 않았습니다.

두 primer 사이에 어느 정도 농도 차이를 준 10:1 조건에서도 ssDNA band는 명확하지 않았습니다.

즉, 단순히 한쪽 primer를 조금 더 많이 넣는 것만으로는 충분한 asymmetric amplification을 유도하기 어려웠습니다.

반면 primer concentration difference를 크게 증가시키자 결과가 달라졌습니다.

특히 160:1인 조건 7과 320:1인 조건 8에서는 ssDNA에 해당하는 product가 확실하게 증가한 것을 확인할 수 있었습니다.

이는 primer ratio가 일정 수준 이상 벌어져야 limiting primer가 빠르게 소진되고 excess primer를 이용한 ssDNA synthesis가 충분하게 진행될 수 있다는 것을 보여줍니다.

추가 실험으로 ssDNA 생성을 확인하다

연구진은 agarose gel 결과만으로 Asy-RPA의 작동을 판단하지 않았습니다.

논문의 그림 B에서는 별도의 분석을 통해 primer ratio에 따른 amplification 결과를 추가로 확인했습니다.

이 결과에서도 두 primer의 concentration difference가 커질수록 Asy-RPA에서 생성되는 ssDNA와 관련된 신호가 더욱 뚜렷하게 나타났습니다.

따라서 primer ratio를 조절하면 RPA에서 생성되는 product의 특성을 dsDNA 중심에서 ssDNA가 축적되는 방향으로 변화시킬 수 있음을 실험적으로 확인했습니다.

이 부분은 이번 논문에서 상당히 중요한 결과입니다.

PAM-free Cas12 detection을 구현하려면 이론적으로 ssDNA를 만들 수 있다는 것만으로는 충분하지 않고 실제로 Cas12를 활성화할 정도의 ssDNA를 확보해야 하기 때문입니다.

Primer Ratio만으로 검출 성능이 결정되지는 않는다

충분한 ssDNA를 생성할 수 있는 조건을 찾은 뒤에는 CRISPR-Cas reaction 자체도 최적화해야 합니다.

Asy-RPA에서 아무리 많은 ssDNA가 생성되더라도 Cas12와 crRNA의 조건이 적절하지 않으면 충분한 collateral cleavage signal을 얻기 어렵습니다.

연구진은 CRISPR-Cas system의 조건과 crRNA concentration을 조절하면서 검출 성능을 비교했습니다.

또한 reaction temperature도 최적화했습니다.

이 기술은 RPA와 Cas12라는 서로 다른 biochemical reaction을 하나의 시스템 안에서 작동시켜야 하기 때문에 어느 한쪽 반응에만 가장 좋은 조건을 선택하는 것보다 전체 assay가 효율적으로 작동하는 조건을 찾는 것이 중요합니다.

이러한 최적화를 통해 Asy-RPA에서 생성된 ssDNA와 Cas12 collateral cleavage를 효과적으로 연결했습니다.

8분 이내의 빠른 핵산 검출을 구현하다

연구진은 primer concentration ratio를 비롯해 Cas12, crRNA, reaction temperature 등의 조건을 조절하면서 전체 검출 시스템을 최적화했습니다.

그 결과 논문에서는 60 copies/μL 수준의 target nucleic acid를 8분 이내에 검출하는 성능을 제시했습니다.

여기에서 주목할 부분은 단순히 검출시간이 짧다는 것만은 아닙니다.

Asymmetric amplification을 이용해 충분한 ssDNA를 생성하고 이를 Cas12의 PAM-independent ssDNA recognition과 직접 연결했다는 점이 중요합니다.

즉, Cas12 protein 자체를 새롭게 engineering하지 않고 Cas12에 전달되는 amplification product의 형태를 조절하는 방식으로 PAM limitation을 줄였습니다.

기존 Two-Step 방식과 다른 점

기존 CRISPR-Cas 기반 검출에서는 amplification과 CRISPR reaction을 순차적으로 진행하는 경우가 많습니다.

이 방법에서는 각 반응을 별도로 최적화하기 쉽지만 assay 단계가 늘어나고 증폭산물을 옮기는 과정도 필요할 수 있습니다.

반대로 amplification과 Cas12를 단순히 한 반응에 넣으면 Cas12가 amplification product를 빠르게 인식하면서 RPA와 간섭할 가능성이 있습니다.

이번 연구는 이 두 문제 사이에서 Asymmetric RPA를 이용한 다른 해결 방법을 제시했습니다.

초기에는 dsDNA를 증폭하면서 target copy를 증가시키고, limiting primer가 소모된 이후에는 ssDNA production을 증가시킵니다.

생성된 ssDNA는 PAM 없이 Cas12를 활성화할 수 있습니다.

따라서

RPA의 amplification 능력

과

Cas12의 PAM-independent ssDNA recognition

이라는 서로 다른 특징을 연결한 것입니다.

이번 연구에서 Asymmetric RPA가 중요한 이유

Asy-RPA를 단순히 ssDNA를 만드는 RPA 변형 기술이라고만 보면 이번 논문의 핵심을 충분히 설명하기 어렵습니다.

일반적인 symmetric RPA는 빠른 exponential amplification을 통해 많은 dsDNA를 만드는 데 유리합니다.

반면 Asy-RPA에서는 limiting primer가 소모된 이후 amplification 효율이 상대적으로 낮아질 수 있습니다.

그럼에도 연구진이 Asy-RPA를 선택한 이유는 최종적인 amplification yield보다 Cas12가 인식할 수 있는 ssDNA를 생성하는 것이 중요했기 때문입니다.

따라서 이번 연구에서 primer ratio는 단순한 최적화 조건이 아닙니다.

Primer ratio가

RPA Product의 형태를 결정하고

→ Cas12 Target Recognition 방식을 바꾸며

→ 결과적으로 PAM-Free Detection을 가능하게 하는

전체 assay의 핵심 설계 요소입니다.

전체 PAM-Free 검출 원리를 정리하면

이번 연구에서 제안한 반응을 순서대로 정리하면 다음과 같습니다.

Double-Stranded Target DNA

→ 서로 다른 농도의 RPA Primer 사용

→ 초기 Symmetric Amplification

→ dsDNA 생성

→ Limiting Primer 소진

→ Asymmetric Amplification

→ 다량의 ssDNA 축적

→ Cas12-crRNA의 ssDNA 인식

→ PAM-Free Cas12 Activation

→ Collateral Cleavage

→ Fluorophore-Quencher ssDNA Reporter 절단

→ Fluorescence Signal 증가

결국 기존 Cas12에서 문제가 될 수 있는 PAM requirement를 Cas protein의 변형으로 해결한 것이 아니라 RPA product를 ssDNA 중심으로 변화시키는 방법으로 해결했다는 것이 이번 연구의 핵심입니다.

논문 리뷰를 마치며

이번 논문에서는 asymmetric RPA와 CRISPR-Cas12를 연결해 PAM에 대한 제약을 줄인 핵산 검출 기술을 살펴봤습니다.

저자들은 먼저 기존 two-step CRISPR assay에서 발생할 수 있는 복잡성과 contamination 문제를 제시하고, RPA와 Cas12를 하나의 시스템으로 연결했을 때 두 반응이 서로 영향을 줄 수 있다는 점에도 주목했습니다.

이를 해결하기 위해 두 RPA primer의 concentration을 크게 다르게 설정했습니다.

반응 초반에는 symmetric RPA를 통해 dsDNA가 증가하지만 limiting primer가 소진된 이후에는 excess primer에 의해 ssDNA가 상대적으로 많이 생성됩니다.

특히 primer ratio를 1:1에서 320:1까지 비교한 결과 160:1과 320:1 조건에서 ssDNA 생성이 뚜렷해지는 결과를 확인했습니다.

이렇게 생성된 ssDNA를 Cas12-crRNA complex가 인식하면 dsDNA target에서와 같은 PAM requirement 없이 collateral cleavage를 활성화할 수 있으며, 최종적으로 fluorescent reporter가 절단되면서 표적 핵산을 검출하게 됩니다.

이번 연구는 새로운 Cas protein을 개발하는 대신 기존 RPA의 primer concentration을 비대칭으로 설계해 Cas12가 가진 ssDNA recognition 특성을 활용했다는 점에서 흥미롭습니다.

단순히 핵산을 더 많이 증폭하는 것이 아니라 최종 검출 기술에 가장 적합한 형태의 핵산을 만들어내도록 amplification을 설계했다는 점에서 Asymmetric RPA의 또 다른 활용 가능성을 보여준 연구라고 볼 수 있습니다.

※ 이 글은 Asymmetric RPA와 CRISPR-Cas12를 이용한 PAM-free 핵산 검출 연구의 원리를 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다.