SURVEYOR Nuclease 원리: DNA 변이 위치를 절단 밴드로 찾는 방법

유전자 검사에서 변이의 위치를 모르는 경우, 모든 PCR 산물을 곧바로 시퀀싱하지 않고 먼저 서열 차이를 탐색할 수 있습니다. SURVEYOR Nuclease는 정상 DNA와 변이 DNA가 결합한 부위의 불일치를 인식해 절단합니다. 절단 산물의 길이를 분석하면 변이의 존재와 대략적인 위치를 추정할 수 있습니다.

1. 500bp DNA에서 변이가 어디에 있는지 어떻게 알 수 있을까?

특정 유전자 영역을 PCR로 증폭해 길이가 500bp인 DNA 산물을 얻었다고 가정하겠습니다.

이 DNA에 단일염기 변이가 존재하더라도 일반적인 agarose gel electrophoresis에서는 정상 DNA와 변이 DNA가 모두 500bp 부근에 나타날 수 있습니다.

염기 하나가 다른 것만으로는 DNA 전체 길이가 달라지지 않기 때문입니다.

이때 변이가 존재하는 위치를 선택적으로 절단할 수 있다면 상황이 달라집니다.

예를 들어 500bp DNA의 한쪽 끝에서 180bp 떨어진 위치에 mismatch가 존재하고, 해당 위치 부근에서 두 가닥이 절단된다면 약 180bp와 320bp 크기의 산물을 관찰할 수 있습니다.

절단 산물의 크기를 합하면 원래 DNA의 길이와 비슷해집니다.

이러한 원리를 이용하면 DNA의 정확한 염기서열을 모두 읽지 않고도 변이가 존재하는 위치를 추정할 수 있습니다.

SURVEYOR Nuclease는 이 목적에 활용되는 mismatch-sensitive endonuclease입니다.

다만 절단 밴드가 나타났다는 사실만으로 특정 변이의 정확한 염기 종류까지 결정할 수는 없습니다.

2. SURVEYOR Nuclease는 어떤 효소일까?

SURVEYOR Nuclease는 식물 유래 CEL nuclease 계열에 속하는 DNA 절단 효소입니다.

이 계열의 대표적인 효소인 CEL I은 셀러리(celery)에서 발견됐습니다.

1998년 Nucleic Acids Research에 발표된 연구에서는 CEL I이 DNA 이중가닥의 구조적 불일치와 mismatch를 인식해 절단할 수 있음을 보고했습니다.

이후 2004년 BioTechniques에 발표된 연구에서는 SURVEYOR Nuclease를 이용해 알려진 변이와 알려지지 않은 변이를 탐색하는 분석법을 제시했습니다.

SURVEYOR Nuclease는 DNA의 염기서열을 직접 읽는 효소가 아닙니다.

정상적인 Watson-Crick 염기쌍과 달리, 서로 맞지 않는 염기가 형성된 DNA 구조를 인식합니다.

대표적으로 단일염기 치환으로 발생한 mismatch와 작은 삽입·결실로 형성된 loop 구조를 절단 대상으로 삼을 수 있습니다.

MutS와 SURVEYOR Nuclease의 차이

MutS는 DNA mismatch에 결합하는 단백질입니다.

반면 SURVEYOR Nuclease는 mismatch를 인식한 뒤 DNA를 절단할 수 있습니다.

이 차이 때문에 SURVEYOR 분석에서는 별도의 전기화학 센서나 형광 결합 측정 장치 없이도 절단 산물을 전기영동으로 확인할 수 있습니다.

하지만 효소가 DNA를 절단하는 효율은 mismatch의 종류와 실험 조건에 따라 달라질 수 있습니다.

3. 정상 DNA와 변이 DNA를 다시 결합시키는 이유

SURVEYOR Nuclease 분석에서 중요한 단계는 heteroduplex를 형성하는 것입니다.

Heteroduplex는 서로 다른 염기서열에서 유래한 DNA 가닥이 결합한 이중가닥입니다.

예를 들어 정상 DNA의 특정 위치가 G이고 변이 DNA가 A라고 가정하겠습니다.

정상 DNA끼리 결합하면 G 염기쌍이 형성됩니다.

변이 DNA끼리 결합하면 A 염기쌍이 형성됩니다.

두 경우 모두 정상적인 상보적 염기쌍이므로 해당 위치에 mismatch가 없습니다.

하지만 정상 DNA와 변이 DNA의 가닥이 서로 결합하면 G 또는 A와 같은 mismatch가 발생할 수 있습니다.

SURVEYOR Nuclease는 이처럼 형성된 불일치 구조를 절단 대상으로 인식합니다.

따라서 변이 DNA가 존재하더라도 heteroduplex가 충분히 형성되지 않으면 검출 효율이 떨어질 수 있습니다.

Heteroduplex 형성 과정

일반적인 분석 과정은 다음과 같습니다.

1. 정상 DNA와 분석 대상 DNA의 표적 영역을 PCR로 증폭합니다.
2. PCR 산물을 혼합하고 가열해 DNA 이중가닥을 분리합니다.
3. 온도를 낮춰 서로 다른 DNA 가닥이 다시 결합하도록 합니다.
4. 형성된 heteroduplex에 SURVEYOR Nuclease를 처리합니다.
5. 절단된 DNA 산물을 전기영동으로 분석합니다.

이때 정상 DNA와 분석 대상 DNA를 혼합하는 이유는 변이 서열이 정상 서열과 결합할 기회를 높이기 위해서입니다.

다만 heteroduplex가 형성됐다고 해서 모든 mismatch가 동일한 효율로 절단되는 것은 아닙니다.

4. 절단 밴드의 길이로 변이 위치를 추정하는 방법

SURVEYOR Nuclease 분석에서는 절단 산물의 크기가 중요한 정보가 됩니다.

가상의 600bp PCR 산물을 예로 들어 보겠습니다.

이 DNA에 한쪽 끝에서 200bp 떨어진 위치에 mismatch가 존재한다고 가정하겠습니다.

효소가 해당 위치 부근에서 DNA를 절단하면 약 200bp와 400bp 크기의 절단 산물이 생성될 수 있습니다.

전기영동에서는 원래의 600bp 밴드와 함께 절단 산물에 해당하는 밴드가 관찰될 수 있습니다.

관찰된 밴드	가능한 의미
600bp	절단되지 않은 PCR 산물
약 200bp	Mismatch 부근에서 절단된 짧은 산물
약 400bp	Mismatch 부근에서 절단된 긴 산물
예상하지 못한 추가 밴드	다른 mismatch, 비특이적 절단 또는 PCR 산물 문제

이 예시는 원리를 설명하기 위한 가상의 분석입니다.

실제 SURVEYOR Nuclease는 mismatch의 3′ 측 인접 위치를 절단할 수 있으며, 절단 효율과 절단 산물의 분포는 효소 및 반응 조건에 따라 달라집니다.

따라서 절단 밴드의 크기를 이용하면 변이의 대략적인 위치를 추정할 수 있지만, 정확한 염기 위치를 결정하려면 sequencing으로 확인해야 합니다.

두 개 이상의 변이가 존재한다면?

하나의 PCR 산물에 여러 변이가 존재하면 여러 위치에서 mismatch가 형성될 수 있습니다.

이 경우 SURVEYOR Nuclease에 의해 다양한 길이의 절단 산물이 생성될 수 있습니다.

하지만 실제 전기영동에서는 일부 밴드가 서로 겹치거나 매우 짧은 절단 산물이 검출되지 않을 수 있습니다.

따라서 여러 밴드가 관찰됐다고 해서 변이 개수를 정확하게 계산할 수 있는 것은 아닙니다.

5. 실제 연구에서 검출 정확도는 얼마나 높았을까?

2009년 The Journal of Molecular Diagnostics에 발표된 연구에서는 SURVEYOR Nuclease를 이용해 신장 관련 유전자의 변이를 탐색했습니다.

연구진은 총 48.2kb의 DNA 영역을 분석했고, 44개의 sequence variation을 확인했습니다.

또한 이미 알려진 15개의 변이를 대상으로 SURVEYOR Nuclease의 검출 능력을 평가했습니다.

그 결과 15개 가운데 14개를 검출했습니다.

이를 비율로 계산하면 약 93%입니다.

이 결과는 SURVEYOR Nuclease가 다양한 DNA 변이를 탐색할 수 있음을 보여줍니다.

그러나 동시에 모든 변이를 검출하지는 못한다는 점도 확인할 수 있습니다.

검출되지 않은 변이는 무엇이었을까?

해당 연구에서 검출되지 않은 변이는 COL4A3 유전자의 단일염기 결실 변이인 c.3533delC였습니다.

연구진은 효소 농도를 높이거나 반응 시간을 늘리는 방법을 검토했지만 해당 변이를 검출하지 못했습니다.

또한 다른 primer를 사용해 PCR 산물을 생성한 경우에도 검출이 어려웠습니다.

반면 DNA sequencing에서는 해당 변이가 확인됐습니다.

이 사례는 중요한 의미를 갖습니다.

SURVEYOR Nuclease에서 절단 밴드가 관찰되지 않았다고 해서 변이가 존재하지 않는다고 단정할 수 없습니다.

특정 mismatch 구조는 효소에 의해 효율적으로 절단되지 않을 수 있기 때문입니다.

6. SURVEYOR와 T7 Endonuclease I은 어떤 차이가 있을까?

DNA mismatch를 절단하는 효소에는 SURVEYOR Nuclease 외에도 T7 Endonuclease I(T7E1)이 있습니다.

T7E1은 박테리오파지 T7에서 유래한 효소로, DNA의 구조적 불일치를 인식해 절단할 수 있습니다.

두 효소 모두 정상 DNA와 변이 DNA의 heteroduplex를 분석하는 데 활용됩니다.

하지만 모든 mismatch에 대한 절단 특성이 동일하지는 않습니다.

2015년 G3: Genes, Genomes, Genetics에 발표된 비교 연구에서는 T7E1과 SURVEYOR Nuclease를 이용해 유전자 편집으로 생성된 변이를 분석했습니다.

연구진은 해당 실험에서 T7E1이 SURVEYOR보다 deletion heteroduplex를 더 민감하게 검출했다고 보고했습니다.

실험 조건에서 T7E1은 약 5%의 deletion mutant DNA를 검출했고, SURVEYOR는 약 10% 수준의 검출한계를 보였습니다.

다만 이는 특정 DNA fragment와 deletion heteroduplex를 대상으로 한 비교 결과입니다.

모든 변이 유형에서 T7E1이 SURVEYOR보다 우수하다는 의미는 아닙니다.

비교 기준	SURVEYOR Nuclease	T7 Endonuclease I
효소 유래	식물 CEL nuclease 계열	박테리오파지 T7
인식 대상	DNA mismatch 및 작은 삽입·결실	DNA mismatch 및 구조적 불일치
대표적 활용	변이 탐색, 유전자 영역 스크리닝	유전자 편집 결과의 초기 평가
결과 확인	절단 산물 전기영동	절단 산물 전기영동
주요 제한 요소	불완전한 절단, 비특이적 분해	변이 조성에 따른 절단 효율 차이

두 효소는 모두 DNA 변이의 존재 가능성을 탐색하는 데 활용할 수 있습니다.

그러나 변이의 정확한 종류와 빈도를 결정하는 데는 제한이 있습니다.

7. CRISPR 유전자 편집 결과를 확인할 때 주의할 점

SURVEYOR Nuclease와 T7E1은 CRISPR-Cas9 유전자 편집 실험에서 사용될 수 있습니다.

CRISPR-Cas9이 DNA를 절단한 뒤 세포가 DNA를 복구하는 과정에서 insertion 또는 deletion(indel)이 발생할 수 있습니다.

이때 편집되지 않은 DNA와 편집된 DNA를 함께 증폭하고 다시 결합시키면 mismatch나 loop 구조가 형성될 수 있습니다.

SURVEYOR Nuclease나 T7E1은 이러한 구조를 인식해 절단합니다.

따라서 절단 밴드가 나타나면 해당 유전자 영역에 sequence variation이 존재할 가능성을 확인할 수 있습니다.

하지만 여기에는 중요한 제한이 있습니다.

절단 밴드가 없으면 편집이 실패한 것일까?

반드시 그렇지는 않습니다.

예를 들어 모든 DNA 분자가 동일한 deletion을 가지고 있다고 가정하겠습니다.

이 DNA끼리 다시 결합하면 서로 완전히 상보적인 이중가닥을 형성할 수 있습니다.

이 경우 mismatch가 없으므로 효소가 절단할 위치가 형성되지 않을 수 있습니다.

따라서 유전자 편집이 성공했더라도 SURVEYOR나 T7E1 분석에서는 절단 밴드가 약하게 나타나거나 검출되지 않을 수 있습니다.

이 문제는 특정 편집 결과가 우세하게 존재하는 세포 집단에서 중요합니다.

2018년 Scientific Reports에 발표된 연구에서는 T7E1 기반 편집 효율 추정값이 targeted NGS 결과와 일치하지 않는 경우가 많다는 점을 확인했습니다.

특히 편집된 세포 집단에서 특정 indel이 우세하게 존재하면 T7E1 결과가 실제 편집 비율을 과소평가할 수 있었습니다.

따라서 CRISPR 편집 효율을 정확하게 평가해야 한다면 targeted NGS와 같은 서열 기반 분석이 더 적합할 수 있습니다.

8. 절단 밴드가 나타났는데 실제 변이가 없는 경우

SURVEYOR Nuclease 분석에서는 위양성도 고려해야 합니다.

가장 중요한 원인 가운데 하나는 비특이적 DNA 절단입니다.

SURVEYOR Nuclease는 mismatch 부근을 절단하지만, 실험 조건에 따라 의도하지 않은 DNA 분해가 발생할 수 있습니다.

특히 일부 연구에서는 SURVEYOR의 exonuclease activity가 분석 결과에 영향을 줄 수 있다고 보고했습니다.

이 경우 실제 mismatch와 관계없는 짧은 DNA fragment가 생성될 수 있습니다.

또한 PCR 과정에서 비특이적 증폭산물이 생성되면 정상 DNA와 변이 DNA의 비교가 어려워질 수 있습니다.

따라서 다음과 같은 대조군을 포함하는 것이 중요합니다.

대조군	확인 목적
정상 DNA만 포함한 대조군	비특이적 절단과 배경 신호 확인
효소를 처리하지 않은 PCR 산물	원래 PCR 산물의 크기와 순도 확인
알려진 변이 DNA 양성 대조군	효소 반응과 절단 검출 여부 확인
DNA가 없는 PCR 음성 대조군	PCR 오염 여부 확인

특히 효소를 처리하지 않은 PCR 산물과 처리한 산물을 비교해야 합니다.

효소 처리 전부터 여러 PCR 밴드가 존재했다면, 효소 처리 후 나타난 모든 밴드를 변이 절단 산물로 해석해서는 안 됩니다.

9. 절단 밴드의 강도로 변이 비율을 계산할 수 있을까?

SURVEYOR와 T7E1 분석에서는 절단된 DNA의 양을 측정해 변이 비율을 추정하는 방법이 사용될 수 있습니다.

하지만 이러한 분석은 여러 가정을 필요로 합니다.

첫째, 정상 DNA와 변이 DNA가 충분히 재결합해야 합니다.

둘째, heteroduplex가 형성된 위치에서 효소가 효율적으로 절단해야 합니다.

셋째, 절단 산물이 전기영동에서 충분히 분리되어야 합니다.

넷째, DNA band intensity가 실제 DNA 양을 적절하게 반영해야 합니다.

이 조건이 충족되지 않으면 변이 비율을 정확하게 계산하기 어렵습니다.

특히 효소의 절단 효율이 100%가 아니라면 실제 heteroduplex가 존재하더라도 일부 DNA는 절단되지 않은 상태로 남습니다.

또한 매우 짧은 절단 산물은 gel에서 관찰되지 않을 수 있습니다.

따라서 SURVEYOR 분석에서 계산한 변이 비율을 원본 검체의 정확한 VAF와 동일하게 해석해서는 안 됩니다.

정확한 변이 정량이 필요한 경우에는 검증된 digital PCR이나 targeted NGS를 활용하는 것이 더 적합할 수 있습니다.

10. SURVEYOR 분석을 선택할 때 확인해야 할 조건

SURVEYOR Nuclease는 특정 유전자 영역에 변이가 존재하는지 빠르게 탐색하는 데 활용할 수 있습니다.

특히 많은 검체를 대상으로 변이 후보를 선별해야 하는 연구에서 유용할 수 있습니다.

그러나 분석 목적에 따라 다른 기술이 더 적합할 수 있습니다.

예를 들어 특정 변이의 정확한 염기서열을 알아야 한다면 sequencing이 필요합니다.

매우 낮은 VAF의 변이를 검출해야 한다면 SURVEYOR의 검출한계가 충분하지 않을 수 있습니다.

또한 CRISPR 편집 효율을 정확하게 계산해야 한다면 단순한 절단 밴드 분석보다 NGS 기반 정량이 더 신뢰성 있는 결과를 제공할 수 있습니다.

SURVEYOR 분석을 계획할 때는 다음 사항을 검토해야 합니다.

• 표적 PCR 산물이 단일한 크기로 증폭되는가?
• 정상 DNA와 분석 대상 DNA의 heteroduplex가 충분히 형성되는가?
• 예상 절단 산물을 전기영동으로 구별할 수 있는가?
• 효소의 비특이적 절단을 확인할 대조군이 있는가?
• 절단 결과를 sequencing으로 확인할 계획이 있는가?

이러한 조건을 충족하면 SURVEYOR Nuclease는 변이 후보를 탐색하는 도구로 활용할 수 있습니다.

다만 최종적인 변이 확인과 임상적 해석에는 별도의 검증이 필요합니다.

11. SURVEYOR Nuclease가 갖는 분석적 가치

SURVEYOR Nuclease의 핵심적인 특징은 DNA mismatch를 물리적인 절단 산물로 변환한다는 점입니다.

MutS처럼 mismatch에 결합하는 단백질과 달리, SURVEYOR는 DNA를 절단해 크기가 다른 fragment를 생성할 수 있습니다.

따라서 복잡한 sequencing 장비 없이도 전기영동을 이용해 변이의 존재 가능성과 대략적인 위치를 탐색할 수 있습니다.

그러나 이 기술이 모든 변이를 동일하게 검출하는 것은 아닙니다.

2009년 연구에서는 알려진 15개 변이 가운데 14개를 검출했지만, 특정 단일염기 결실은 검출하지 못했습니다.

또한 2015년 비교 연구에서는 특정 deletion heteroduplex에 대한 검출한계가 효소에 따라 달라질 수 있음을 확인했습니다.

이러한 결과는 SURVEYOR 분석을 사용할 때 절단 밴드의 유무만으로 변이 존재 여부를 확정해서는 안 된다는 점을 보여줍니다.

SURVEYOR Nuclease는 정확한 염기서열을 결정하는 기술이 아니라, DNA 서열 차이가 존재할 가능성이 높은 검체와 위치를 선별하는 기술입니다.

따라서 변이 후보 탐색에는 유용하지만, 정확한 변이 종류와 빈도를 확인해야 하는 경우에는 sequencing 기반 분석과 함께 활용하는 것이 적절합니다.

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참고문헌

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셀러리 유래 CEL I nuclease가 DNA mismatch를 인식하고 절단하는 특성을 보고한 초기 연구입니다.

2. Qiu P, Shandilya H, D’Alessio JM, et al. (2004).

Mutation detection using Surveyor nuclease.

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DOI: https://doi.org/10.2144/04364PF01

SURVEYOR Nuclease를 이용해 알려진 변이와 알려지지 않은 변이를 탐색하는 방법을 제시한 연구입니다.

3. Voskarides K, Deltas C. (2009).

Screening for mutations in kidney-related genes using SURVEYOR nuclease for cleavage at heteroduplex mismatches.

The Journal of Molecular Diagnostics, 11(4), 311–318.

DOI: https://doi.org/10.2353/jmoldx.2009.080144

신장 관련 유전자에서 SURVEYOR Nuclease의 변이 탐색 능력을 평가하고, 알려진 15개 변이 가운데 14개를 검출한 연구입니다.

4. Comparison of T7E1 and Surveyor Mismatch Cleavage Assays to Detect Mutations Triggered by Engineered Nucleases. (2015).

G3: Genes, Genomes, Genetics.

원문: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4349094/

T7E1과 SURVEYOR의 절단 특성과 검출한계를 비교한 연구입니다.

5. Sentmanat MF, Peters ST, Florian CP, et al. (2018).

A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.

Scientific Reports, 8, 888.

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-018-19441-8

CRISPR 유전자 편집 효율을 평가하는 T7E1, TIDE, IDAA, targeted NGS의 결과를 비교한 연구입니다.

※ 본 글은 공개된 학술논문을 바탕으로 SURVEYOR Nuclease의 DNA mismatch 절단 원리와 연구 결과를 설명한 교육용 콘텐츠입니다. 특정 연구에서 보고된 검출한계와 민감도가 모든 유전자 변이 또는 임상 검체에 동일하게 적용되는 것은 아닙니다.