In Vitro Transcription(IVT) 원리, DNA 주형에서 RNA는 어떻게 만들어질까?
In vitro transcription(IVT)은 DNA의 유전정보를 시험관 안에서 RNA로 전사하는 기술입니다. T7 RNA polymerase가 promoter를 찾는 과정부터 RNA 합성이 시작되고 종료되기까지 IVT의 핵심 원리를 살펴보겠습니다.
세포 밖에서도 DNA를 RNA로 만들 수 있다
생명체의 세포에서는 DNA에 저장된 유전정보가 RNA로 전사됩니다.
그렇다면 세포가 없는 시험관에서도 같은 반응을 구현할 수 있을까요?
가능합니다.
이를 in vitro transcription(IVT), 시험관 내 전사라고 합니다.
IVT에서는 DNA template와 RNA polymerase, ribonucleotide 등의 필요한 구성요소를 시험관 안에 넣어 RNA를 합성합니다.
특히 bacteriophage에서 유래한 T7 RNA polymerase는 높은 promoter specificity와 transcription 효율 때문에 연구실에서 널리 사용됩니다.
IVT의 기본 개념을 간단히 나타내면 다음과 같습니다.
DNA Template → RNA Polymerase의 Promoter 인식 → RNA 합성
PCR이 DNA를 이용해 DNA를 증폭하는 기술이라면 IVT는 DNA 정보를 이용해 RNA를 만들어내는 기술이라는 점에서 차이가 있습니다.
IVT에는 무엇이 필요할까?
T7 RNA polymerase를 이용한 기본적인 IVT에는 몇 가지 구성요소가 필요합니다.
- DNA template
- T7 promoter
- T7 RNA polymerase
- ATP, GTP, CTP, UTP
- 적절한 buffer와 magnesium ion
- 반응 목적에 따른 기타 첨가물
여기에서 ATP, GTP, CTP, UTP는 RNA를 구성하는 ribonucleoside triphosphate(NTP)입니다.
RNA polymerase는 DNA template의 정보를 읽으면서 이 NTP들을 차례로 연결해 RNA strand를 만들어냅니다.
DNA polymerase가 DNA 합성에 dNTP를 이용하는 것과 비교하면 차이를 이해하기 쉽습니다.
T7 Promoter는 RNA 합성의 출발점을 알려준다
DNA template만 있다고 해서 T7 RNA polymerase가 원하는 위치에서 마음대로 전사를 시작하지는 않습니다.
Polymerase가 인식할 수 있는 T7 promoter가 필요합니다.
T7 promoter를 설명할 때 흔히 다음과 같은 대표적인 서열을 볼 수 있습니다.
5′-TAATACGACTCACTATA-3′
하지만 이 서열만 외우면 promoter와 실제 transcription start site의 관계를 혼동하기 쉽습니다.
T7 promoter는 RNA polymerase가 결합하고 전사를 시작할 위치를 지정하는 영역이며, promoter의 위치는 일반적으로 transcription start site를 +1로 정하고 그보다 upstream에 있는 염기를 음수 번호로 표현합니다.
대표적인 T7 class III promoter에서는 약 -17부터 +6까지의 영역이 transcription initiation에 영향을 줄 수 있습니다.
따라서 T7 promoter는 정확히 17개의 염기다 또는 20개의 염기다라고 단순하게 정의하기보다 polymerase recognition에 필요한 upstream promoter와 전사가 시작되는 초기 서열을 구분하는 것이 중요합니다.
+1은 무슨 의미일까?
전사가 실제로 시작되는 첫 번째 nucleotide를 일반적으로 +1 position이라고 부릅니다.
그 앞쪽은 -1, -2, -3처럼 표시하고 뒤쪽으로는 +2, +3처럼 표시합니다.
T7 RNA polymerase는 +1 위치에서 흔히 guanosine(G)으로 전사를 시작하는 것을 선호합니다.
또 +1 이후 초기 transcribed sequence 역시 transcription efficiency에 영향을 줄 수 있습니다.
그래서 실험용 T7 IVT template를 살펴보면 promoter 바로 뒤에 하나 이상의 G가 배치된 경우가 많습니다.
하지만 이를 GGG가 반드시 있어야 T7 transcription이 시작된다고 이해해서는 안 됩니다.
T7 RNA polymerase는 다른 초기 서열에서도 transcription을 수행할 수 있으며, 시작 부분의 sequence context에 따라 RNA yield와 5′ end의 균일성 등이 달라질 수 있습니다.
즉, G-rich initial sequence는 효율적인 transcription을 위한 설계 요소가 될 수 있지만 모든 IVT에 필요한 절대적인 규칙은 아닙니다.
T7 RNA Polymerase가 DNA에 결합하면 무슨 일이 일어날까?
T7 RNA polymerase가 promoter를 인식하면 transcription initiation이 시작됩니다.
먼저 promoter 주변의 DNA가 부분적으로 열리고 template strand의 염기정보가 노출됩니다.
RNA polymerase는 template DNA와 상보적인 ribonucleotide를 선택하여 새로운 RNA를 합성합니다.
예를 들어 DNA template의 특정 위치에 cytosine(C)이 있다면 RNA에는 이에 상보적인 guanosine(G)이 들어갈 수 있습니다.
RNA가 어느 정도 합성되고 안정적인 elongation complex가 만들어지면 polymerase는 promoter에서 벗어나 DNA template를 따라 이동합니다.
이후 elongation 단계에서 RNA chain이 계속 길어집니다.
따라서 IVT는 크게 다음과 같은 과정으로 이해할 수 있습니다.
Promoter Recognition → Initiation → Promoter Escape → Elongation → Termination
단순히 T7 polymerase가 DNA에 붙어서 RNA를 만든다보다 이 단계들을 구분하면 IVT 반응 조건에 따라 RNA 생산량이 달라지는 이유도 이해하기 쉬워집니다.
DNA 한 분자에서는 RNA도 하나만 만들어질까?
그렇지 않습니다.
IVT가 RNA 생산에 유용한 중요한 이유입니다.
DNA template 자체가 한 번 사용되고 사라지는 것이 아니기 때문에 하나의 DNA template에서 반복적으로 transcription이 시작될 수 있습니다.
한 RNA polymerase가 template를 따라 이동하는 동안 다른 polymerase가 promoter에서 새로운 transcription을 시작할 수도 있습니다.
결과적으로 하나의 DNA template로부터 여러 RNA transcript를 생성할 수 있습니다.
DNA Template 1개
→ 반복적인 Transcription Initiation
→ 다수의 RNA Transcript
이것이 IVT가 RNA를 효율적으로 생산할 수 있는 기본적인 이유입니다.
RNA가 만들어지면 반응은 어디에서 끝날까?
RNA polymerase가 무한정 DNA를 따라 이동하는 것은 아닙니다.
Template의 구조와 설계에 따라 transcription이 종료됩니다.
연구실에서 특정 길이의 RNA를 생산할 때는 linearized plasmid DNA 또는 원하는 위치에서 끝나도록 제작한 linear DNA template를 사용할 수 있습니다.
Linear template라면 polymerase가 template 끝에 도달하면서 run-off transcript를 생성할 수 있습니다.
반대로 plasmid가 적절하게 linearization되지 않은 상태라면 의도하지 않은 길이의 RNA가 만들어질 가능성도 고려해야 합니다.
또 T7 terminator와 같은 termination sequence를 사용하는 설계도 가능합니다.
따라서 IVT에서 원하는 길이의 RNA를 얻으려면 promoter뿐 아니라 template의 끝을 어떻게 설계했는지도 중요합니다.
IVT의 결과물이 항상 하나의 완벽한 RNA일까?
IVT 반응의 효율이 높다고 해서 만들어진 RNA가 모두 완전히 동일한 것은 아닙니다.
T7 RNA polymerase를 이용한 IVT에서는 조건에 따라 의도한 RNA 외에 다양한 부산물이 발생할 수 있습니다.
예를 들어 transcription initiation 과정에서 짧은 abortive transcript가 생성될 수 있습니다.
또 template와 RNA sequence에 따라 예상보다 길거나 짧은 transcript 또는 double-stranded RNA(dsRNA) 부산물이 발생할 가능성도 있습니다.
특히 mRNA와 같이 생물학적 용도로 RNA를 사용하는 경우에는 RNA의 양뿐 아니라 순도와 구조적 균일성도 중요합니다.
따라서 실제 IVT 공정에서는 transcription 이후 DNA template 제거, RNA purification 및 품질 분석 등의 과정이 추가될 수 있습니다.
Promoter를 짧게 만들면 IVT 효율이 항상 높아질까?
원문에서 소개한 것처럼 T7 promoter 길이를 조절하여 transcription 효율을 개선하려는 연구들이 존재합니다.
그러나 기존 20-base promoter보다 12~16 base promoter가 더 효율적이다라는 결과를 모든 IVT에 적용되는 일반적인 규칙으로 받아들이기는 어렵습니다.
T7 RNA polymerase의 transcription efficiency는 단순히 promoter의 총 길이 하나로 결정되지 않습니다.
다음과 같은 요소들이 함께 영향을 줄 수 있습니다.
- Promoter sequence
- Promoter와 +1의 위치 관계
- Initial transcribed sequence
- DNA template 구조
- 목표 RNA의 sequence와 길이
- NTP 및 Mg²⁺ 농도
- RNA polymerase 농도
- 반응시간과 온도
특정 연구에서 truncated promoter가 특정 조건의 transcription을 향상시켰더라도 다른 RNA template와 assay에서 동일한 결과가 나온다고 보장할 수 없습니다.
따라서 promoter engineering 연구는 T7 transcription을 최적화하는 여러 전략 중 하나로 이해하는 것이 적절합니다.
PCR 산물을 바로 IVT Template로 사용할 수 있을까?
가능합니다.
IVT가 분자진단 기술과 연결되는 중요한 지점입니다.
PCR primer에 T7 promoter sequence를 포함하도록 설계하면 PCR amplification 과정에서 최종 DNA product에 T7 promoter를 추가할 수 있습니다.
이 DNA를 T7 RNA polymerase가 인식하면 RNA transcript를 만들 수 있습니다.
개념적으로는 다음과 같습니다.
Target DNA
→ T7 Promoter가 포함된 PCR
→ Promoter-containing dsDNA
→ T7 RNA Polymerase
→ RNA
RPA와 같은 등온증폭 기술에도 비슷한 전략을 적용할 수 있습니다.
앞선 Cas13 글에서 살펴본 SHERLOCK에서도 이런 연결 방식이 중요한 역할을 합니다.
Cas13은 왜 IVT와 함께 등장할까?
Cas13 계열은 대표적으로 RNA를 표적으로 인식하는 CRISPR effector입니다.
그런데 RPA나 PCR의 최종 산물은 DNA입니다.
DNA를 그대로 Cas13에 넣으면 원하는 RNA-targeting 반응을 연결할 수 없습니다.
여기에 IVT를 넣으면 문제가 해결됩니다.
T7 promoter가 포함된 DNA amplification product를 만들고 T7 RNA polymerase로 transcription하면 Cas13이 인식할 RNA를 생성할 수 있습니다.
DNA Amplification
→ T7 IVT
→ RNA
→ Cas13-crRNA Recognition
→ Collateral RNA Cleavage
→ Reporter Signal
이 구조에서 IVT는 단순히 RNA를 많이 만드는 역할만 하는 것이 아닙니다.
DNA 기반 증폭 시스템과 RNA 기반 CRISPR 검출 시스템을 연결하는 molecular bridge 역할을 합니다.
NASBA와 IVT는 같은 기술일까?
NASBA에서도 T7 RNA polymerase가 사용되기 때문에 IVT와 혼동할 수 있습니다.
하지만 두 개념은 동일하지 않습니다.
IVT는 기본적으로 DNA template에서 RNA를 합성하는 transcription reaction 자체를 의미합니다.
NASBA는 reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase 등의 효소를 조합하여 핵산을 연속적으로 증폭하는 isothermal amplification system입니다.
| 구분 | T7 IVT | NASBA |
|---|---|---|
| 핵심 목적 | DNA에서 RNA 합성 | 핵산 증폭 |
| 핵심 효소 | T7 RNA polymerase | RT, RNase H, T7 RNA polymerase 등 |
| Template | T7 promoter가 포함된 DNA | 주로 RNA 표적 활용 |
| 주요 산물 | RNA transcript | 다량의 RNA |
| 반응 특징 | Transcription | 순환적인 amplification |
즉, NASBA 안에서 T7 RNA polymerase가 수행하는 transcription은 IVT와 관련된 반응이지만 NASBA 전체를 IVT라고 부를 수는 없습니다.
mRNA 백신에서도 IVT가 사용되는 이유
IVT는 분자진단에만 사용되는 기술이 아닙니다.
mRNA 생산에서도 매우 중요한 역할을 합니다.
원하는 단백질 정보를 가진 DNA template를 제작하고 이를 이용해 IVT를 수행하면 많은 양의 mRNA를 생산할 수 있습니다.
다만 백신용 mRNA 제조는 단순히 T7 polymerase로 RNA를 만들면 끝나는 과정이 아닙니다.
효율적인 translation과 RNA 안정성을 위해 5′ cap, untranslated regions(UTRs), poly(A) tail 등의 요소를 고려해야 합니다.
또 제조 방식에 따라 modified nucleoside를 사용할 수 있으며 IVT 이후에는 DNA template와 불필요한 부산물을 제거하는 purification과 품질관리가 필요합니다.
따라서 실험실에서 짧은 RNA reporter를 만드는 IVT와 의약품 제조용 mRNA IVT는 기본적인 transcription 원리는 공유하지만 요구되는 공정과 품질 수준은 크게 다릅니다.
RNA Light-up Aptamer와 IVT의 연결
IVT를 진단 신호 발생에 직접 이용하는 연구도 가능합니다.
대표적인 접근 중 하나가 RNA light-up aptamer입니다.
특정 RNA aptamer는 작은 fluorogenic molecule과 결합했을 때 강한 형광을 나타내도록 설계할 수 있습니다.
따라서 핵산 인식 반응의 결과로 특정 RNA aptamer가 transcription되도록 시스템을 구성하면 RNA 생성 자체를 형광신호와 연결할 수 있습니다.
이 경우에는 별도의 형광단백질을 만드는 과정 없이 RNA와 작은 분자의 결합으로 optical signal을 얻을 수 있습니다.
다만 light-up aptamer의 종류마다 ligand, RNA folding, 형광 특성과 반응 조건이 다르기 때문에 하나의 보편적인 진단 원리로 일반화하기보다 IVT를 signal generation과 연결하는 응용 전략 중 하나로 이해하는 것이 좋습니다.
IVT의 핵심은 DNA를 ‘복제’하는 것이 아니라 정보를 RNA로 옮기는 것
PCR과 IVT는 모두 DNA template를 사용할 수 있기 때문에 처음에는 비슷하게 느껴질 수 있습니다.
하지만 목적은 전혀 다릅니다.
PCR에서는 DNA polymerase가 DNA template를 이용해 새로운 DNA를 만듭니다.
IVT에서는 RNA polymerase가 DNA template의 정보를 읽어 새로운 RNA를 만듭니다.
T7 RNA polymerase를 이용한 IVT에서는 promoter가 transcription의 시작 위치를 지정하고, polymerase가 NTP를 연결하면서 RNA chain을 합성합니다.
하나의 DNA template에서 반복적으로 transcription을 시작할 수 있기 때문에 많은 RNA를 생산할 수도 있습니다.
이 특성 덕분에 IVT는 단순한 RNA 합성법을 넘어 mRNA 생산, RNA 연구, CRISPR-Cas13 검출, 등온 핵산 분석 및 다양한 synthetic biology 시스템을 연결하는 기반 기술로 활용되고 있습니다.
※ 본문은 in vitro transcription의 분자생물학적 원리와 연구 활용을 설명하기 위한 교육용 콘텐츠입니다. 의약품 제조를 위한 실제 IVT 공정이나 임상적 사용 지침을 제공하기 위한 내용은 아닙니다.
