Entropy-Driven Catalytic Reaction을 활용한 무효소 DNA 신호 증폭 기술

DNA strand displacement 반응은 새로운 염기쌍을 많이 만드는 경우에만 진행되는 것은 아닙니다. Entropy-Driven Catalytic Reaction은 반응 전후의 전체 base pairing이 크게 달라지지 않더라도 결합된 복합체가 여러 독립적인 분자로 분리될 때 얻는 엔트로피 이득을 이용해 신호 반응을 진행할 수 있습니다.

Entropy-Driven Reaction이란 무엇일까?

DNA 기반 molecular circuit에서는 상보적인 strand 사이의 hybridization을 이용해 반응을 설계할 수 있습니다.

가장 쉽게 생각할 수 있는 구동력은 더 많은 base pair가 형성되는 것입니다.

두 single strand가 결합해 안정적인 duplex가 되면 thermodynamically 유리한 상태가 될 수 있습니다.

하지만 DNA reaction의 자유에너지는 base-pair formation만으로 결정되지 않습니다.

반응 과정에서 몇 개의 독립적인 molecular species가 존재하는지도 중요합니다.

하나의 복잡한 DNA complex가 여러 개의 분리된 product로 전환되면 system이 가질 수 있는 상태의 수가 증가할 수 있습니다.

이러한 entropy gain을 reaction의 중요한 driving force로 활용하는 것이 entropy-driven DNA circuit의 핵심 개념입니다.

Enthalpy와 Entropy를 구분해야 한다

Chemical reaction의 spontaneity를 설명할 때 Gibbs free energy는 일반적으로 다음 관계로 표현할 수 있습니다.

ΔG = ΔH − TΔS

여기에서 ΔH는 enthalpy 변화, ΔS는 entropy 변화입니다.

DNA hybridization에서는 새로운 base pair 형성과 stacking interaction이 안정성에 크게 기여합니다.

하지만 entropy-driven reaction에서는 반응 전후에 형성된 전체 base pair 수를 크게 바꾸지 않으면서도 reaction을 진행하도록 설계할 수 있습니다.

즉, 단순히

더 많은 Base Pair = 더 안정한 Product

라는 구조에만 의존하지 않습니다.

결합되어 있던 여러 DNA strand가 독립적인 product로 분리되면서 얻는 entropy contribution을 활용할 수 있습니다.

여러 Strand가 하나의 Complex를 만든 상태에서 시작한다

대표적인 entropy-driven DNA circuit에서는 여러 oligonucleotide가 미리 결합된 substrate complex를 준비할 수 있습니다.

이 complex 안에는 서로 다른 기능을 가진 strand가 포함됩니다.

예를 들면

Substrate Strand

Signal Strand

Fuel Strand

과 같은 역할을 갖도록 설계할 수 있습니다.

실제 명칭과 구조는 assay에 따라 달라질 수 있지만 핵심은 여러 strand가 하나의 복합체 안에 묶여 있다는 것입니다.

Target 또는 catalyst strand가 들어오면 strand displacement가 연속적으로 발생하면서 기존 complex가 해체됩니다.

최종적으로 여러 개의 독립된 product strand가 생성됩니다.

Catalyst가 Toehold에 결합하면서 반응이 시작된다

Entropy-driven circuit에서도 toehold-mediated strand displacement가 중요한 기본 반응으로 사용됩니다.

Catalyst strand는 substrate complex에 노출된 toehold를 먼저 인식합니다.

상보적인 sequence가 결합하면 branch migration이 시작됩니다.

그 결과 complex에 결합되어 있던 strand 하나가 밀려날 수 있습니다.

첫 단계는 다음과 같이 표현할 수 있습니다.

Catalyst

→ Toehold Binding

→ Branch Migration

→ Intermediate Complex Formation

이때 catalyst가 최종 product에 영구적으로 갇히지 않도록 reaction network를 설계하는 것이 중요합니다.

Fuel Strand가 Catalyst를 다시 방출한다

첫 번째 strand displacement 이후에는 catalyst가 intermediate complex에 결합된 상태가 될 수 있습니다.

이 상태에서 별도의 fuel strand가 새로운 toehold를 인식하도록 설계할 수 있습니다.

Fuel이 intermediate에 결합하면 다시 strand displacement가 진행됩니다.

그 결과 catalyst가 complex에서 방출됩니다.

즉,

Catalyst Binding

→ 첫 번째 Strand Displacement

→ Fuel Binding

→ 두 번째 Strand Displacement

→ Catalyst Release

가 이루어집니다.

방출된 catalyst는 다른 substrate complex를 찾아가 같은 reaction을 다시 시작할 수 있습니다.

Catalyst가 소모되지 않는 것이 증폭의 핵심이다

Target strand가 한 번 반응하고 최종 product에 포함되어 버린다면 target 하나당 한 번의 signal event만 만들 수 있습니다.

Entropy-driven catalytic circuit에서는 target 또는 target-derived strand가 catalyst처럼 작동하도록 설계할 수 있습니다.

반응이 끝난 뒤 catalyst가 다시 방출되면 새로운 substrate와 반응할 수 있습니다.

따라서

Catalyst 1개

→ Substrate 1 변환

→ Catalyst 재생

→ Substrate 2 변환

→ Catalyst 재생

과정이 반복될 수 있습니다.

결과적으로 하나의 target이 여러 substrate를 signal-producing product로 전환할 수 있습니다.

이것이 target recycling에 기반한 signal amplification입니다.

Target DNA의 Copy Number가 증가하는 것은 아니다

Entropy-driven catalytic reaction을 ‘DNA 증폭’이라고 표현할 때 주의해야 할 부분입니다.

PCR처럼 target DNA 자체가 복제되는 것은 아닙니다.

Polymerase가 새로운 target copy를 합성하는 과정도 필수적이지 않습니다.

대신 target이 catalyst 역할을 하면서 여러 reporter substrate를 반복적으로 변환합니다.

따라서 더 정확하게 구분하면

PCR → Target Amplification

Entropy-Driven Circuit → Signal Amplification

입니다.

Target copy number는 그대로 유지되더라도 target 하나가 여러 output을 생성하기 때문에 측정 가능한 signal이 커질 수 있습니다.

반응 전후 Base Pair 수가 비슷해도 진행될 수 있다

이 기술에서 가장 흥미로운 부분입니다.

일반적인 hybridization reaction에서는 새로운 duplex가 형성되면서 많은 base pair를 얻는 방향으로 반응을 설계할 수 있습니다.

Entropy-driven circuit에서는 반응 전과 후의 total base-pairing energy 차이를 상대적으로 작게 만들 수 있습니다.

대신 하나의 복합체가 여러 독립적인 species로 분리되는 방향을 이용합니다.

예를 들어 여러 strand가 하나의 substrate complex를 이루고 있다가 reaction 후 두 개 이상의 독립된 product complex와 strand로 나뉠 수 있습니다.

이 과정에서 molecular species가 더 자유롭게 존재할 수 있는 상태가 증가합니다.

따라서 reaction의 driving force를 단순히 새로운 base pair 형성량만으로 설명해서는 안 됩니다.

왜 이것을 Entropy Gain이라고 부를까?

Entropy는 흔히 ‘무질서도’라고 설명되지만 molecular reaction에서는 가능한 microscopic state의 수와 연결해서 이해하는 편이 더 정확합니다.

여러 DNA strand가 하나의 complex에 묶여 있으면 각 strand가 독립적으로 움직일 수 있는 자유가 제한됩니다.

Reaction 후 여러 molecule로 분리되면 translational freedom이 증가할 수 있습니다.

따라서 전체 system이 가질 수 있는 가능한 상태의 수가 증가합니다.

이러한 entropy contribution이 reaction을 product 방향으로 진행시키는 데 도움을 줄 수 있습니다.

즉, entropy-driven circuit은 단순히 DNA가 ‘흩어지기 때문에’ 작동하는 것이 아니라 reaction network의 thermodynamic balance를 product 쪽으로 설계한 molecular system입니다.

Fuel Strand는 왜 필요한가?

Fuel strand라는 이름 때문에 자동차 연료처럼 에너지를 직접 방출하는 molecule이라고 생각하기 쉽습니다.

DNA circuit에서 fuel은 주로 reaction pathway를 다음 단계로 진행시키는 oligonucleotide입니다.

Catalyst가 substrate와 결합한 intermediate에 fuel이 접근하면 새로운 strand displacement가 일어납니다.

이 과정에서 catalyst가 다시 방출될 수 있습니다.

따라서 fuel의 중요한 역할은

Intermediate Resolution

과

Catalyst Recycling

입니다.

Fuel이 충분하지 않다면 catalyst가 intermediate에 갇히면서 turnover가 제한될 수 있습니다.

Fluorescence Reporter와 어떻게 연결할까?

DNA strand displacement 자체는 눈으로 볼 수 없습니다.

따라서 reaction product를 fluorescence와 연결할 수 있습니다.

예를 들어 signal strand에 fluorophore를 연결하고 초기 substrate complex에서는 quencher와 가까이 있도록 설계할 수 있습니다.

Target-dependent catalytic reaction이 진행되면 signal strand가 complex에서 방출됩니다.

Fluorophore와 quencher 사이의 거리가 증가하면서 fluorescence가 나타납니다.

전체 과정은

Target Recognition

→ Catalytic Strand Displacement

→ Signal Strand Release

→ Fluorophore-Quencher Separation

→ Fluorescence Increase

로 연결할 수 있습니다.

Reporter Release가 반복되면 Signal이 커진다

Target이 catalyst로 재생되는 구조에서는 하나의 target이 첫 번째 reporter를 방출한 뒤 반응을 종료하지 않습니다.

다음 substrate complex에 다시 결합합니다.

두 번째 reporter가 방출됩니다.

그 다음 세 번째 substrate로 이동합니다.

따라서 시간이 지나면서 reporter product가 축적될 수 있습니다.

반응을 개념적으로 표현하면

Target + Substrate

→ Reporter 1 + Target

Target + Substrate

→ Reporter 2 + Target

Target + Substrate

→ Reporter 3 + Target

처럼 볼 수 있습니다.

Target이 소비되지 않기 때문에 catalytic turnover가 가능한 것입니다.

Enzyme-Free Amplification이라는 점이 특징이다

Entropy-driven DNA circuit은 적절한 oligonucleotide 구조만으로 구성할 수 있습니다.

Polymerase가 DNA를 합성하거나 nuclease가 strand를 절단해야만 작동하는 구조가 아닙니다.

Reaction의 핵심은

Sequence-Specific Hybridization

과

Toehold-Mediated Strand Displacement

입니다.

따라서 적절한 설계에서는 enzyme-free signal amplification을 구현할 수 있습니다.

이는 enzyme activity에 필요한 cofactor나 복잡한 enzymatic condition을 줄일 수 있다는 연구적 장점이 있습니다.

하지만 enzyme을 사용하지 않는다고 해서 reaction condition의 영향을 받지 않는 것은 아닙니다.

Temperature, salt concentration, oligonucleotide concentration과 sequence design은 여전히 매우 중요합니다.

TMSD와 Entropy-Driven Circuit의 차이

앞서 살펴본 Toehold-Mediated Strand Displacement는 하나의 strand가 toehold에 결합한 뒤 branch migration을 통해 기존 strand를 밀어내는 기본적인 molecular mechanism입니다.

Entropy-driven catalytic circuit은 이러한 TMSD event를 여러 단계로 연결한 reaction network입니다.

따라서 두 개념의 관계는

TMSD = 기본적인 Strand Exchange Mechanism

Entropy-Driven Circuit = 여러 TMSD를 연결해 Catalyst Recycling과 Product Formation을 구현한 System

으로 정리할 수 있습니다.

TMSD 하나가 자동으로 signal amplification을 만드는 것은 아닙니다.

Catalyst가 다시 방출되고 여러 substrate를 연속적으로 변환할 수 있어야 amplification이 가능합니다.

CHA와는 무엇이 다를까?

Catalytic Hairpin Assembly 역시 enzyme 없이 target recycling을 이용해 signal을 증폭할 수 있습니다.

CHA에서는 metastable hairpin H1과 H2가 핵심 구성 요소입니다.

Target이 H1을 열고 H2가 이어서 결합하면서 H1-H2 complex가 형성되고 target이 방출됩니다.

Entropy-driven circuit에서는 반드시 두 hairpin이 assembly되는 구조를 사용할 필요가 없습니다.

여러 strand로 구성된 substrate complex가 단계적인 strand displacement를 통해 분해되고 catalyst가 재생되는 구조를 사용할 수 있습니다.

따라서 두 기술 모두 target recycling을 사용할 수 있지만 molecular architecture와 thermodynamic design이 다릅니다.

HCR과도 증폭 방식이 다르다

HCR에서는 initiator가 hairpin을 열면 H1과 H2가 번갈아 결합하면서 긴 nicked double-stranded polymer가 형성됩니다.

즉, signal amplification이 polymer growth와 연결됩니다.

Entropy-driven catalytic reaction에서는 긴 polymer를 만드는 것이 필수적이지 않습니다.

Catalyst 하나가 여러 substrate complex를 독립적인 product로 변환하면서 output molecule을 축적할 수 있습니다.

따라서

HCR → Initiator-Triggered Chain Assembly

Entropy-Driven Circuit → Catalyst Recycling에 의한 Substrate Turnover

라는 차이가 있습니다.

Single Nucleotide Mutation을 구별할 수 있을까?

Entropy-driven DNA circuit에서도 target recognition은 sequence-specific hybridization에 기반합니다.

따라서 target과 recognition domain 사이에 mismatch가 존재하면 reaction kinetics가 달라질 수 있습니다.

특히 초기 toehold binding이나 branch migration 시작 지점에 mismatch가 위치하면 reaction rate가 크게 감소하도록 설계할 가능성이 있습니다.

이를 이용하면 wild-type과 mutant DNA를 구별하는 sensor를 만들 수 있습니다.

하지만 mismatch 하나만 넣으면 자동으로 높은 specificity가 생기는 것은 아닙니다.

Toehold length, mismatch position, sequence composition과 reaction temperature에 따라 discrimination이 달라집니다.

miRNA 검출에도 적용할 수 있다

짧은 miRNA를 catalyst 또는 catalyst-release trigger로 이용할 수도 있습니다.

Target miRNA가 substrate complex의 특정 toehold를 인식하면 strand displacement가 시작됩니다.

Reaction 후 miRNA가 다시 방출되도록 설계하면 동일한 miRNA가 여러 substrate를 변환할 수 있습니다.

따라서 짧고 낮은 농도의 miRNA recognition event를 여러 reporter release event로 전환할 수 있습니다.

이 방식에서는 miRNA 자체를 복제하지 않으므로 reverse transcription이나 PCR 없이 signal amplification을 구현하는 연구가 가능합니다.

다만 실제 biological sample에서는 RNA degradation과 secondary structure를 고려해야 합니다.

Target을 직접 Catalyst로 사용하지 않을 수도 있다

Target이 항상 catalytic circuit에 직접 들어가야 하는 것은 아닙니다.

Target recognition을 별도의 probe에서 수행하고 그 결과로 catalyst strand가 방출되도록 설계할 수 있습니다.

예를 들어 초기 상태에서는 catalyst가 protector strand와 결합해 inactive 상태로 존재합니다.

Target이 들어오면 protector를 displacement하거나 구조를 변화시켜 catalyst를 방출합니다.

그 다음 catalyst가 entropy-driven circuit으로 이동합니다.

즉,

Target

→ Recognition Probe

→ Catalyst Release

→ Entropy-Driven Reaction

→ Reporter Accumulation

과 같은 구조입니다.

이 방식은 target recognition module과 amplification module을 분리할 수 있다는 장점이 있습니다.

여러 Reaction을 Cascade로 연결할 수도 있다

첫 번째 entropy-driven circuit에서 방출된 output strand를 두 번째 circuit의 catalyst로 사용할 수 있습니다.

그러면

Target

→ Circuit 1

→ Output A

→ Circuit 2

→ Output B

처럼 cascade를 만들 수 있습니다.

이론적으로 signal gain을 더 높일 수 있습니다.

또한 서로 다른 input이 존재해야 다음 circuit이 활성화되도록 설계하면 molecular logic operation도 구현할 수 있습니다.

하지만 stage가 늘어날수록 leak reaction이 누적될 수 있으므로 단순히 cascade 수를 늘리는 것이 항상 좋은 것은 아닙니다.

가장 큰 문제는 Leak Reaction이다

Target이 없는데도 substrate가 천천히 product로 전환되면 background signal이 발생합니다.

Entropy-driven circuit은 여러 strand displacement reaction을 연결하기 때문에 작은 unintended interaction도 최종 signal에 영향을 줄 수 있습니다.

예를 들어 substrate complex가 일시적으로 열리면서 숨겨져 있어야 할 toehold가 노출될 수 있습니다.

Fuel이 의도하지 않은 영역에 결합할 수도 있습니다.

서로 다른 probe 사이에 partial complementarity가 존재할 수도 있습니다.

이러한 reaction이 발생하면 catalyst 없이도 reporter가 방출될 수 있습니다.

따라서 높은 sensitivity를 얻으려면 signal amplification보다 먼저 leak suppression을 고려해야 합니다.

Toehold를 길게 만들면 항상 좋은 것은 아니다

Toehold가 길고 안정적이면 원하는 strand가 빠르게 결합할 수 있습니다.

하지만 unintended strand도 부분적으로 상보적인 sequence를 가지고 있다면 background reaction이 빨라질 수 있습니다.

반대로 toehold가 너무 짧으면 원하는 target조차 안정적으로 결합하지 못해 reaction이 느려질 수 있습니다.

따라서 toehold design은

Reaction Speed

Specificity

Leakage

사이의 균형을 맞추는 작업입니다.

복잡한 circuit에서는 각 reaction 단계마다 서로 다른 toehold strength를 설정해 reaction order와 kinetics를 조절할 수도 있습니다.

Secondary Structure와 Crosstalk도 고려해야 한다

DNA strand가 설계한 대로 항상 자유롭게 존재하는 것은 아닙니다.

한 strand 내부에서 hairpin이 형성될 수 있고 서로 다른 circuit component가 예상하지 못한 duplex를 만들 수도 있습니다.

이러한 secondary structure와 crosstalk는 effective concentration을 낮추거나 unintended reaction을 유도할 수 있습니다.

특히 여러 target을 동시에 검출하는 multiplex circuit에서는 서로 다른 toehold와 branch migration domain이 교차 반응하지 않도록 설계해야 합니다.

따라서 sequence orthogonality가 중요한 요소가 됩니다.

실제 생체시료에서는 조건이 더 복잡하다

Synthetic DNA를 이용한 buffer 실험에서는 각 strand의 concentration과 ionic condition을 정밀하게 조절할 수 있습니다.

하지만 serum, plasma 또는 cell lysate에서는 다양한 protein, salt와 nuclease가 존재합니다.

Probe DNA가 분해될 수 있고 target accessibility도 달라질 수 있습니다.

Sample component가 hybridization kinetics에 영향을 줄 수도 있습니다.

따라서 buffer에서 높은 amplification efficiency가 나타났다는 사실만으로 실제 clinical sample에서 동일한 성능을 기대할 수는 없습니다.

Sample preparation과 matrix effect를 별도로 검증해야 합니다.

Entropy-Driven Biosensor의 기본 반응을 정리하면

Target 자체가 catalyst 역할을 하는 fluorescence assay를 가정하면 다음과 같습니다.

Target이 없는 경우

Substrate Complex + Fuel

→ Catalyst 없음

→ Strand Displacement 제한

→ Signal Strand 유지

→ Low Fluorescence

Target이 존재하는 경우

Target Catalyst

→ Exposed Toehold Binding

→ First Strand Displacement

→ Intermediate Formation

→ Fuel Binding

→ Second Strand Displacement

→ Signal Strand Release

→ Target Catalyst Regeneration

→ 다음 Substrate와 반응

→ Fluorescence Accumulation

이 cycle이 반복되면서 target보다 많은 signal product가 생성될 수 있습니다.

다른 핵산 증폭 기술과 비교하면

기술	핵심 구동 방식	효소 사용	증폭 대상
PCR	Polymerase-mediated DNA synthesis	필요	Target DNA
RCA	Circular template 복제	필요	DNA product
DSN Recycling	Probe cleavage와 target 재생	필요	Reporter turnover
CHA	Hairpin assembly와 target recycling	불필요	Signal complex
HCR	연속적인 hairpin assembly	불필요	Polymer signal
Entropy-Driven Circuit	Strand displacement와 catalyst recycling	불필요	Signal product

Entropy-driven reaction의 차별점은 단순히 ‘enzyme-free’라는 데 있지 않습니다.

반응 전후의 molecular organization과 catalyst recycling을 이용해 thermodynamically 유리한 product formation을 설계한다는 것이 핵심입니다.

분자진단 연구에서 갖는 의미

분자진단에서는 낮은 농도의 target을 어떻게 큰 signal로 바꿀 것인지가 중요한 문제입니다.

PCR처럼 target 자체를 복제하는 것이 가장 직접적인 방법이지만 모든 sensor가 nucleic acid amplification을 필요로 하는 것은 아닙니다.

Entropy-driven catalytic circuit은 target을 보존하면서 여러 reporter substrate를 변환할 수 있습니다.

또한 reaction pathway가 DNA sequence에 의해 결정되므로 target recognition, amplification, logic processing과 reporter generation을 하나의 programmable nucleic acid network 안에 설계할 수 있습니다.

이러한 특징은 단순한 fluorescent sensor뿐 아니라 DNA computing과 synthetic molecular circuit 연구에도 연결됩니다.

마치며

Entropy-Driven Catalytic Reaction은 DNA strand displacement와 catalyst recycling을 이용해 외부 enzyme 없이 signal을 증폭할 수 있는 molecular reaction입니다.

Target 또는 target-derived catalyst가 substrate complex의 toehold를 인식하면 strand displacement가 시작됩니다.

이후 fuel strand가 intermediate를 변환하면서 signal strand를 방출하고 catalyst를 다시 재생할 수 있습니다.

전체적인 과정은

Catalyst Recognition

→ Toehold Binding

→ Strand Displacement

→ Fuel-Mediated Intermediate Conversion

→ Signal Product Release

→ Catalyst Regeneration

→ Reaction Cycle 반복

으로 정리할 수 있습니다.

이 과정에서 target DNA를 새롭게 복제하는 것은 아닙니다. 하나의 target이 여러 substrate를 반복적으로 변환함으로써 signal product가 축적됩니다.

또한 reaction의 구동력을 새로운 base pair의 대량 형성에만 의존하지 않고 여러 결합 strand가 독립적인 product로 분리되면서 얻는 entropy contribution과 함께 설계할 수 있다는 점이 특징입니다.

따라서 entropy-driven DNA circuit의 핵심은 단순한 ‘무효소 증폭’보다 DNA sequence와 molecular organization을 이용해 catalyst가 재사용되는 thermodynamic reaction network를 프로그래밍한다는 것에 있습니다.

※ 본 글은 Entropy-Driven Catalytic Reaction과 핵산 바이오센서의 원리를 설명하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다. 연구 단계에서 보고된 분석 성능을 확립된 임상 진단검사의 성능으로 해석해서는 안 됩니다.