DETECTR 논문 리뷰, RT-LAMP와 CRISPR-Cas12로 SARS-CoV-2를 검출한 방법

DETECTR는 핵산을 먼저 증폭한 뒤 Cas12의 trans-cleavage로 표적 여부를 확인하는 CRISPR 진단 플랫폼입니다. 2020년 논문에서는 RT-LAMP와 결합해 SARS-CoV-2 RNA를 약 30~40분 안에 판독하는 방법을 제시했습니다.

DETECTR는 코로나19 때 처음 만들어진 기술일까?

그렇지는 않습니다.

DETECTR는 DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter의 약자입니다.

2018년 Chen 연구진은 Cas12a가 표적 DNA를 인식한 뒤 주변의 single-stranded DNA를 비특이적으로 절단하는 trans-cleavage activity를 보인다는 사실을 보고했습니다.

연구진은 이 활성을 등온 핵산 증폭과 결합해 HPV DNA를 검출하는 플랫폼을 만들었고 이를 DETECTR라고 이름 붙였습니다.

즉, DETECTR의 핵심 아이디어는 이미 2018년에 제시됐습니다.

2020년 Broughton 연구진은 이 원리를 SARS-CoV-2 RNA 검출에 적용하면서 RT-LAMP + Cas12 + lateral flow라는 형태의 진단 시스템을 구성했습니다.

따라서 코로나19 DETECTR 논문은 새로운 Cas12 현상을 발견한 연구라기보다 기존 DETECTR 개념을 실제 감염성 바이러스 검출에 확장한 연구로 보는 것이 적절합니다.

이 논문은 왜 PCR 대신 RT-LAMP를 선택했을까?

2020년 논문의 목표는 SARS-CoV-2 RNA를 비교적 간단한 장비 환경에서 빠르게 검출하는 것이었습니다.

당시 표준적인 핵산 검사에는 real-time RT-PCR이 사용됐지만 thermal cycling이 필요했습니다.

연구진은 앞단의 핵산 증폭에 RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)​를 사용했습니다.

SARS-CoV-2는 RNA 바이러스이므로 먼저 RNA 정보를 DNA로 바꾸는 reverse transcription이 필요합니다.

이후 LAMP의 strand displacement 기반 증폭이 이어지면서 많은 DNA amplicon이 생성됩니다.

전체 구조를 단순화하면 다음과 같습니다.

SARS-CoV-2 RNA
→ Reverse Transcription
→ LAMP 증폭
→ 많은 dsDNA 생성

논문에서는 RT-LAMP를 약 62℃에서 20~30분 수행했습니다.

E gene과 N gene을 동시에 본 이유

연구진은 SARS-CoV-2의 두 영역을 분석 대상으로 선택했습니다.

하나는 E gene(envelope gene)​이고, 다른 하나는 N gene(nucleoprotein gene)​입니다.

하지만 두 표적의 역할은 동일하지 않았습니다.

논문에서 E gene용 guide는 SARS-CoV-2를 포함한 일부 SARS-like coronavirus를 폭넓게 인식하도록 설계됐고, N gene용 guide는 SARS-CoV-2에 더 특이적으로 반응하도록 설계했습니다.

따라서 두 유전자를 동시에 사용한 목적을 단순히 두 개를 검사하면 위양성과 위음성이 크게 줄어든다고 표현하기보다 서로 다른 특이성을 가진 두 표적을 조합해 판독 신뢰성을 높이는 설계라고 보는 것이 정확합니다.

논문에서는 E와 N이 모두 검출되면 positive, 둘 중 하나만 검출되면 presumptive positive로 해석하는 판독 구조를 사용했습니다.

RT-LAMP 다음에 왜 Cas12가 또 필요할까?

RT-LAMP만으로도 DNA는 많이 만들어집니다.

그런데 증폭이 일어났다는 사실과 원하는 SARS-CoV-2 서열이 정확히 증폭됐는지는 별개의 문제입니다.

여기에서 CRISPR-Cas12가 두 번째 sequence-recognition 단계로 작동합니다.

Cas12와 guide RNA가 복합체를 형성하고, guide와 상보적인 표적 DNA가 존재하면 Cas12가 활성화됩니다.

이중가닥 DNA를 인식하는 Cas12a는 적절한 PAM 조건도 필요로 합니다.

논문에서도 LAMP primer를 설계할 때 Cas12 guide가 사용할 수 있는 표적 위치와 PAM 조건을 함께 고려했습니다.

Cas12가 올바른 표적을 확인하면 target DNA를 절단하는 것뿐 아니라 주변의 ssDNA를 비특이적으로 자르는 trans-cleavage activity가 활성화됩니다.

이것이 DETECTR의 이름에 들어가는 Trans Reporter와 연결됩니다.

Cas12가 표적을 찾으면 Reporter가 대신 잘린다

Cas12 기반 진단에서 실제 판독에 사용하는 것은 짧은 ssDNA reporter입니다.

형광 검출용 reporter라면 한쪽 끝에는 fluorophore, 반대쪽에는 quencher를 붙일 수 있습니다.

Reporter가 온전할 때는 두 물질이 가까워 형광이 억제됩니다.

SARS-CoV-2 표적 DNA가 존재해 Cas12가 활성화되면 주변 ssDNA reporter가 절단됩니다.

그러면 fluorophore와 quencher가 분리되고 형광이 증가합니다.

즉,

SARS-CoV-2 DNA 증폭산물
→ Cas12-gRNA 인식
→ Cas12 활성화
→ ssDNA Reporter 절단
→ 형광 증가

라는 방식입니다.

Cas12의 target-activated nonspecific ssDNA cleavage는 DETECTR의 출발점이 된 2018년 연구에서 핵심적으로 입증됐습니다.

형광 없이 Strip으로도 결과를 볼 수 있었다

2020년 SARS-CoV-2 DETECTR 논문에서 중요한 특징 중 하나는 fluorescence reader뿐 아니라 lateral flow strip으로도 결과를 읽었다는 점입니다.

이 방식에서는 FAM과 biotin이 양 끝에 붙은 ssDNA reporter를 사용했습니다.

대표적인 구조는 다음과 같습니다.

FAM — ssDNA — Biotin

표적이 없어 Cas12가 활성화되지 않으면 reporter가 온전하게 유지됩니다.

반대로 표적이 존재하면 Cas12의 trans-cleavage로 reporter가 잘리면서 FAM과 biotin이 서로 분리됩니다.

Strip은 이 두 상태를 서로 다른 capture line에서 구분하도록 설계됩니다.

논문에서는 intact reporter가 첫 번째 capture line에 포획되고, Cas12에 의해 reporter가 절단되면 두 번째 detection line에서 신호가 나타나는 구조를 사용했습니다.

따라서 DETECTR의 lateral flow는 항원 자체를 잡는 신속항원검사와 원리는 다릅니다.

항원을 직접 검출하는 대신 CRISPR에 의해 잘린 핵산 reporter의 상태를 읽는 방식입니다.

전체 반응 시간은 얼마나 걸렸을까?

논문에서 사용한 DETECTR 반응은 크게 두 단계였습니다.

먼저 RT-LAMP를 약 62℃에서 20~30분 진행합니다.

다음으로 Cas12 detection을 약 37℃에서 10분가량 수행했습니다.

연구진은 전체 assay가 약 30~40분 정도에 수행될 수 있다고 보고했습니다.

또 동일한 RT-LAMP amplicon을 이용한 실험에서는 Cas12 fluorescence 신호가 1분 이내에 검출되기 시작했고, lateral flow에서는 약 5분 안에 육안 신호를 얻을 수 있었습니다.

다만 이것을 검체 채취부터 최종 진단까지 무조건 40분이라고 받아들이면 안 됩니다.

논문에서는 이미 RNA가 추출된 호흡기 검체를 DETECTR의 입력으로 사용했습니다.

실제 전체 검사시간에는 검체 처리와 핵산 추출 과정이 추가될 수 있습니다.

정말 10 copies까지 검출했을까?

2020년 논문에서는 SARS-CoV-2 N gene RNA 표준물질을 이용해 분석적 검출한계를 평가했습니다.

DETECTR assay는 약 10 copies/μL reaction 수준에서 lateral flow 신호를 확인했습니다.

흥미로운 점은 같은 논문에서 비교한 CDC qRT-PCR assay의 추정 LoD가 약 1 copy/μL reaction이었다는 것입니다.

따라서 원문의 DETECTR가 PCR과 유사하거나 더 높은 효율을 보였다는 표현은 수정해야 합니다.

적어도 해당 논문의 분석적 LoD 비교에서는 CDC qRT-PCR이 더 낮은 농도까지 검출했습니다.

DETECTR 논문의 장점은 단순히 PCR보다 검출한계가 낮다는 데 있지 않았습니다.

등온증폭, CRISPR 기반 sequence recognition, lateral flow 판독을 결합해 비교적 간단하고 빠른 검출 플랫폼을 구성했다는 점​이 중요했습니다.

실제 환자 검체에서는 어떤 결과가 나왔을까?

연구진은 합성 RNA만 평가한 것이 아니라 임상 검체도 사용했습니다.

논문에는 COVID-19 감염 환자 36명과 다른 바이러스성 호흡기 감염 환자 42명의 검체가 포함됐습니다.

CDC RT-PCR 결과를 기준으로 비교했을 때 연구진은 DETECTR에서 95% positive predictive agreement와 100% negative predictive agreement를 보고했습니다.

여기에서도 표현을 주의해야 합니다.

이를 곧바로 민감도 95%, 특이도 100%가 입증됐다고 모든 상황에 일반화하는 것은 적절하지 않습니다.

해당 수치는 이 연구의 검체 구성과 판정 기준에서 얻어진 초기 임상 검증 결과입니다.

더 다양한 환자집단과 실제 임상환경에서 성능을 확인하려면 추가 연구가 필요합니다.

DETECTR의 특이도는 Cas12 하나가 만드는 것이 아니다

DETECTR를 CRISPR를 붙여 특이도를 높인 기술이라고만 설명하면 중요한 부분을 놓칠 수 있습니다.

실제로는 여러 선택 단계가 존재합니다.

첫 번째는 LAMP primer입니다.

원하는 표적 영역이 제대로 증폭되어야 합니다.

두 번째는 Cas12 guide RNA입니다.

증폭된 DNA 가운데 guide와 상보적인 올바른 표적이 있어야 Cas12가 활성화됩니다.

즉,

LAMP Primer Selection
+
Cas12-gRNA Recognition

이라는 두 단계의 sequence selection이 존재합니다.

이 구조가 비특이적 LAMP 산물을 무조건 양성으로 읽는 것을 방지하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

다만 그렇다고 위양성과 위음성을 완전히 없애는 것은 아닙니다.

검체 품질, primer 설계, amplification contamination, guide specificity 등의 영향을 여전히 받을 수 있습니다.

SHERLOCK과 DETECTR는 무엇이 다를까?

두 플랫폼은 구조적으로 상당히 비슷합니다.

둘 다 핵산을 먼저 증폭하고 CRISPR effector가 원하는 표적을 확인한 다음 reporter cleavage를 판독합니다.

하지만 사용하는 구성요소가 다릅니다.

구분	DETECTR	SHERLOCK
대표 CRISPR effector	Cas12a	Cas13a
대표 pre-amplification	RT-LAMP 등	RPA/RT-RPA
Cas가 인식하는 표적	주로 DNA	RNA
Collateral substrate	ssDNA	ssRNA
중간 transcription	기본 구조에서는 불필요	T7 transcription 사용
대표 readout	형광, lateral flow	형광, lateral flow

이 차이 때문에 DETECTR는 RT-LAMP에서 만들어진 dsDNA를 Cas12가 바로 인식할 수 있습니다.

반면 SHERLOCK에서는 RPA로 생성된 DNA를 Cas13이 읽을 수 있도록 T7 transcription을 이용해 RNA로 바꾸는 과정이 필요합니다.

따라서 DETECTR는 DNA amplification과 Cas12 detection을 직접 연결한다는 구조적 단순성이 특징 가운데 하나입니다.

DETECTR는 PCR을 대체할 수 있는 기술일까?

2020년 논문에서 DETECTR는 빠르고 시각적으로 판독할 수 있는 SARS-CoV-2 검출법의 가능성을 보여줬습니다.

하지만 이를 PCR보다 뛰어나므로 앞으로 PCR을 대체한다고 결론짓는 것은 적절하지 않습니다.

실제 해당 연구에서도 분석적 LoD는 CDC qRT-PCR보다 높았습니다.

또 DETECTR는 여러 LAMP primer와 Cas guide를 설계해야 하고 RT-LAMP 반응과 Cas12 검출을 순차적으로 진행해야 합니다.

반대로 real-time RT-PCR은 이미 자동화된 장비, 정량적 데이터, 표준화된 workflow와 방대한 임상검증 경험이 구축돼 있습니다.

따라서 두 기술은 단순한 우열 관계가 아닙니다.

DETECTR는 thermal cycling 없이 빠른 핵산 증폭이 가능하고 Cas12로 추가적인 서열 확인을 수행하며 lateral flow 같은 간단한 readout으로 확장할 수 있다는 다른 장점을 가진 기술입니다.

이 논문의 핵심은 ‘증폭과 확인을 따로 맡긴 것’

DETECTR의 구조를 가장 간단하게 정리하면 다음과 같습니다.

SARS-CoV-2 RNA
→ RT-LAMP
→ 많은 DNA 생성
→ Cas12-gRNA가 표적 서열 확인
→ ssDNA Reporter 절단
→ 형광 또는 LFA 판독

여기에서 RT-LAMP와 Cas12는 서로 같은 일을 하지 않습니다.

RT-LAMP는 표적 핵산의 양을 늘리는 역할을 담당합니다.

Cas12는 증폭된 DNA에 원하는 서열이 존재하는지 확인하고 reporter를 절단하는 역할을 담당합니다.

마지막으로 fluorescence 또는 lateral flow가 분자 수준의 절단 반응을 사람이 읽을 수 있는 신호로 바꿉니다.

2020년 논문은 이러한 역할 분담을 이용해 RNA 추출물에서 SARS-CoV-2를 약 30~40분 안에 검출할 수 있는 시스템을 제시했습니다.

따라서 DETECTR의 의미는 단순히 LAMP에 CRISPR를 추가하면 더 강력해진다는 데 있지 않습니다.

핵산 증폭 → CRISPR 기반 서열 확인 → 시각적 판독이라는 서로 다른 기능을 하나의 분자진단 플랫폼으로 연결했다는 것이 이 연구에서 가장 중요한 부분입니다.

※ 본문은 2020년 Nature Biotechnology에 발표된 SARS-CoV-2 DETECTR 연구와 관련 기술의 원리를 이해하기 위한 교육 목적의 논문 리뷰입니다. 특정 진단법의 임상 성능이나 개인의 검사 결과를 판단하기 위한 의료정보가 아닙니다.