CRISPR Cas13 진단 원리, RNA 절단을 형광과 LFA 신호로 읽는 방법

Cas13 기반 진단에서는 표적 RNA를 찾는 것만큼 결과를 읽어내는 방법이 중요합니다. Cas13이 RNA reporter를 절단했을 때 형광이나 LFA 밴드가 어떻게 달라지는지 살펴보겠습니다.

Cas13이 RNA를 찾아도 그대로는 결과를 볼 수 없다

CRISPR-Cas13은 crRNA가 지정한 RNA 서열을 선택적으로 인식할 수 있습니다.

표적 RNA가 Cas13-crRNA complex에 결합하면 Cas13의 RNase 활성이 활성화되고, 주변에 존재하는 다른 single-stranded RNA도 절단할 수 있습니다.

이를 collateral cleavage 또는 trans-cleavage라고 합니다.

분자진단에서는 이 독특한 활성을 그대로 사용하는 것이 아니라, Cas13이 일부러 자를 수 있도록 만든 RNA reporter를 함께 넣습니다.

Cas13이 표적을 찾았는지를 reporter의 상태 변화로 확인하는 것입니다.

따라서 Cas13 기반 진단을 이해할 때는 다음 두 역할을 구분하면 쉽습니다.

• crRNA-Cas13: 원하는 RNA 서열 인식
• RNA reporter: Cas13 활성화를 측정 가능한 신호로 변환

Cas13의 collateral RNase 활성을 reporter와 연결하는 것이 SHERLOCK을 비롯한 여러 CRISPR 진단 플랫폼의 기본 아이디어입니다.

형광 Reporter는 어떻게 Cas13 활성을 보여줄까?

가장 대표적인 판독 방법 중 하나가 fluorescence detection입니다.

형광 방식에 사용하는 RNA reporter는 짧은 RNA 양 끝에 일반적으로 다음 두 물질을 배치합니다.

Fluorophore — RNA — Quencher

Fluorophore는 특정 조건에서 빛을 내는 형광물질이고, quencher는 가까이에 있는 fluorophore의 형광을 억제합니다.

Reporter가 절단되지 않았을 때는 fluorophore와 quencher가 가까운 거리에 있기 때문에 형광이 낮게 유지됩니다.

표적 RNA가 존재하면 Cas13이 활성화되고 collateral cleavage에 의해 reporter RNA가 절단됩니다.

이때 fluorophore와 quencher 사이의 거리가 멀어지면서 억제됐던 형광신호가 증가합니다.

즉,

표적 RNA 인식 → Cas13 활성화 → RNA reporter 절단 → 형광 증가

라는 관계가 만들어집니다.

실제로 Cas13 기반 검출 연구에서는 fluorophore와 quencher가 결합된 RNA reporter를 이용해 collateral cleavage를 형광신호로 변환하는 방식이 널리 사용돼 왔습니다.

형광신호가 강하면 표적 RNA도 반드시 많은 걸까?

Cas13 fluorescence assay에서는 시간에 따른 형광 변화를 측정할 수 있습니다.

그러나 형광 강도를 단순히 표적 RNA의 양과 일대일 대응시키는 것은 주의해야 합니다.

최종 형광신호에는 다음과 같은 여러 요소가 영향을 미칠 수 있기 때문입니다.

• 초기 표적 핵산 농도
• 앞단의 핵산 증폭 효율
• crRNA의 표적 인식 성능
• Cas13 효소 농도와 활성
• RNA reporter 농도
• 반응시간과 온도

따라서 Cas13 fluorescence assay를 정량적으로 활용하려면 해당 시스템에 맞는 calibration과 검증이 필요합니다.

형광을 측정한다는 사실만으로 qPCR과 동일한 방식의 정량법이 되는 것은 아닙니다.

LFA는 형광 없이 어떻게 결과를 보여줄까?

형광 방식은 민감한 신호 측정에 유용하지만 fluorescence reader 같은 광학 장비가 필요할 수 있습니다.

장비 없이 육안으로 결과를 확인하는 방법 가운데 하나가 Lateral Flow Assay(LFA)​입니다.

LFA는 액체가 membrane을 따라 이동하면서 특정 물질이 정해진 위치에 포획되고, 그곳에 금 나노입자와 같은 색을 내는 물질이 모여 밴드를 형성하는 기술입니다.

Cas13 기반 LFA에서는 항원 자체를 검출하는 일반적인 신속검사와 달리 RNA reporter가 잘렸는지 여부를 읽도록 strip을 설계할 수 있습니다.

대표적인 SHERLOCKv2 계열 방식에서는 FAM과 biotin으로 양쪽 끝을 표지한 RNA reporter가 사용됐습니다.

FAM-RNA-Biotin Reporter의 역할

Cas13 LFA에서 사용되는 대표적인 reporter는 다음과 같은 구조를 가집니다.

FAM — RNA — Biotin

FAM과 biotin에는 각각 다른 역할이 있습니다.

FAM은 anti-FAM antibody가 인식할 수 있는 표지이고, biotin은 streptavidin과 강하게 결합할 수 있습니다.

따라서 reporter가 온전할 때는 FAM과 biotin이 하나의 RNA로 연결돼 있습니다.

Cas13의 collateral cleavage가 일어나면 RNA가 끊어지면서 FAM이 붙은 fragment와 biotin이 붙은 fragment가 서로 분리될 수 있습니다.

LFA에서는 바로 이 두 표지가 연결돼 있는지 분리돼 있는지를 이용합니다.

눈에 보이는 밴드는 Gold Nanoparticle이 만든다

FAM이나 biotin 자체가 육안으로 진한 색을 내는 것은 아닙니다.

그래서 Cas13 lateral flow 시스템에서는 gold nanoparticle(AuNP)​이 흔히 사용됩니다.

대표적인 시스템에서는 금 나노입자 표면에 anti-FAM antibody가 결합돼 있습니다.

RNA reporter의 FAM이 anti-FAM antibody와 결합하면 reporter와 gold nanoparticle이 하나의 complex 형태로 membrane을 따라 이동할 수 있습니다.

금 나노입자가 특정 line에 충분히 모이면 붉거나 자주빛 계열의 눈에 보이는 밴드가 형성됩니다.

각 구성요소의 역할을 나누면 다음처럼 정리할 수 있습니다.

구성요소	주요 역할
FAM	Anti-FAM antibody가 인식하는 표지
Biotin	Streptavidin과 결합
RNA	Cas13이 절단할 수 있는 reporter 연결부
Anti-FAM antibody	FAM 포획
Gold nanoparticle	육안으로 확인할 색 신호 생성

Reporter가 온전하면 어떤 일이 일어날까?

표적 RNA가 없다면 Cas13은 충분히 활성화되지 않고 reporter가 온전하게 남습니다.

FAM과 biotin이 하나의 RNA에 연결된 상태입니다.

대표적인 SHERLOCKv2 lateral flow 구조에서는 FAM 쪽에 anti-FAM antibody-gold nanoparticle complex가 붙고, reporter의 biotin은 streptavidin이 있는 line에서 포획될 수 있습니다.

결과적으로 gold nanoparticle까지 함께 특정 위치에 모이면서 밴드가 형성됩니다.

이 경우 중요한 것은 몇 번째 줄이 control line인가를 외우는 것이 아닙니다.

온전한 reporter는 FAM과 biotin을 동시에 가지고 있기 때문에 biotin을 이용한 capture가 가능하다는 점이 핵심입니다.

Cas13이 Reporter를 자르면 이동 방식이 달라진다

반대로 표적 RNA가 존재해 Cas13이 활성화되면 FAM-RNA-biotin reporter가 절단됩니다.

이때 FAM과 biotin이 서로 분리될 수 있습니다.

FAM fragment는 anti-FAM antibody-gold nanoparticle과 계속 결합할 수 있지만 biotin이 없기 때문에 이전과 같은 streptavidin capture가 일어나지 않습니다.

따라서 complex가 membrane을 더 멀리 이동하고 다른 capture molecule이 위치한 line에서 붙잡히도록 설계할 수 있습니다.

SHERLOCKv2의 대표적인 구조에서는 이러한 원리를 이용해 reporter cleavage 상태에 따라 strip에서 신호가 나타나는 위치를 변화시켰습니다.

즉,

온전한 Reporter
→ FAM과 Biotin 연결
→ 특정 위치에서 포획

절단된 Reporter
→ FAM과 Biotin 분리
→ AuNP-FAM complex의 이동 위치 변화

라는 차이를 읽는 것입니다.

양성이면 항상 두 줄이 나타날까?

Cas13 lateral flow assay를 설명할 때 가장 조심해야 하는 부분입니다.

양성은 두 줄, 음성은 한 줄이라는 규칙을 모든 Cas13 LFA에 적용할 수는 없습니다.

어떤 strip에서는 reporter cleavage로 두 번째 밴드가 나타나는 방식이 사용될 수 있지만, 다른 시스템에서는 첫 번째 line의 강도가 감소하면서 다른 line으로 신호가 이동하도록 구성할 수도 있습니다.

Capture molecule 역시 streptavidin, protein A, anti-species antibody 등 assay 설계에 따라 달라질 수 있습니다.

따라서 LFA의 핵심을 다음처럼 이해하는 편이 정확합니다.

Cas13이 Reporter를 절단함
→ Reporter의 두 표지가 분리됨
→ Strip에서 포획되는 위치가 달라짐
→ 밴드 패턴 변화

실제 양성·음성 판정은 사용하는 LFA 시스템의 제조사 또는 assay protocol에서 정한 기준을 따라야 합니다.

형광과 LFA는 결국 같은 반응을 본다

두 판독법은 겉으로 매우 다르게 보입니다.

하지만 Cas13 입장에서 보면 똑같은 사건을 측정합니다.

RNA reporter가 절단됐는가?

차이는 절단을 어떤 신호로 변환하는지에 있습니다.

구분	형광 검출	LFA 검출
Reporter 예	Fluorophore-RNA-Quencher	FAM-RNA-Biotin
Cas13 활성 결과	RNA 절단	RNA 절단
신호 원리	Quenching 해제	표지물질의 포획 위치 변화
결과 확인	형광신호 측정	밴드 확인
장비	광학 측정기 사용 가능	육안 판독 가능
활용 방향	신호 변화 측정	간편한 현장형 판독

따라서 fluorescence와 lateral flow는 서로 다른 Cas13 기술이 아니라 같은 collateral cleavage를 읽는 두 가지 방법이라고 이해하면 됩니다.

Cas13 앞에 RT-RPA를 사용하는 이유

Cas13은 RNA를 인식할 수 있지만 실제 검체에서 표적 RNA가 매우 적다면 충분한 신호를 만들기 어려울 수 있습니다.

이를 해결하기 위해 표적 핵산을 먼저 증폭하는 과정이 사용됩니다.

대표적인 Cas13 기반 플랫폼인 SHERLOCK에서는 RPA가 중요한 역할을 합니다.

RNA 표적을 분석하는 경우에는 reverse transcription을 포함한 RT-RPA 방식을 이용해 표적 정보를 DNA 형태로 증폭할 수 있습니다.

여기에서 한 가지 문제가 생깁니다.

RPA 결과물은 DNA이지만 Cas13이 최종적으로 인식하는 것은 RNA입니다.

그래서 중간에 T7 RNA transcription을 추가합니다.

DNA 증폭산물이 다시 RNA로 바뀌는 과정

RT-RPA를 통해 표적 RNA의 정보를 포함하는 많은 DNA 증폭산물이 만들어지면 T7 RNA polymerase를 이용해 이를 RNA로 전사할 수 있습니다.

이를 위해 RPA primer 등의 설계에 T7 promoter를 포함시키는 전략이 사용될 수 있습니다.

최종적으로 전체 과정은 다음처럼 연결됩니다.

표적 RNA
→ Reverse Transcription
→ RPA DNA 증폭
→ T7 Transcription
→ 많은 RNA 생성
→ Cas13-crRNA 표적 인식
→ RNA Reporter 절단
→ 형광 또는 LFA 판독

즉, Cas13 앞의 핵산 증폭은 Cas13이 인식할 표적 분자의 수를 증가시키는 역할을 합니다.

Cas13의 collateral cleavage는 그 이후 RNA reporter를 여러 번 절단하면서 검출 가능한 신호를 생성하는 역할을 합니다.

두 종류의 증폭을 구분해서 이해하는 것이 중요합니다.

SHERLOCK은 여러 기술을 하나의 진단 시스템으로 연결했다

Cas13 기반 진단의 대표적인 사례가 SHERLOCK입니다.

SHERLOCK은 Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing의 약자입니다.

대표적인 초기 SHERLOCK에서는 RNA 표적에 대해 RT-RPA를 이용할 수 있고, RPA 증폭산물을 T7 transcription으로 RNA로 바꾼 뒤 Cas13을 이용해 검출하는 구조가 제시됐습니다.

SHERLOCKv2에서는 여기에 lateral flow readout, multiplex detection 및 보조적인 신호 증폭 방법 등이 추가됐습니다.

중요한 것은 Cas13 하나가 모든 과정을 담당하는 것이 아니라는 점입니다.

• RT-RPA: 표적 핵산 정보 증폭
• T7 RNA polymerase: DNA를 RNA로 전사
• Cas13-crRNA: 표적 RNA 확인
• Collateral cleavage: Reporter 절단
• Fluorescence 또는 LFA: 사람이 읽을 수 있는 출력 생성

분자진단 시스템은 여러 단계가 각각 다른 역할을 맡도록 설계되는 경우가 많습니다.

Cas13의 진단 활용에서 Reporter가 중요한 이유

Cas13의 RNA 인식 능력만으로는 결과를 직접 눈으로 확인할 수 없습니다.

분자 수준에서 일어난 변화를 사람과 장비가 읽을 수 있는 신호로 변환해야 실제 검출 기술이 됩니다.

Fluorescence reporter는 RNA 절단을 빛의 증가로 바꿉니다.

FAM-biotin reporter와 LFA는 RNA 절단을 membrane상의 밴드 위치와 강도 변화로 바꿉니다.

따라서 Cas13 진단의 핵심을 하나의 연결 관계로 정리하면 다음과 같습니다.

표적 RNA 인식 → Cas13 활성화 → RNA Reporter 절단 → Reporter 상태 변화 → 판독 가능한 신호

앞서 Cas13의 원리를 이해했다면, 이번에는 collateral cleavage라는 분자 반응을 어떤 방식으로 실제 검사 결과로 변환하는가에 주목하는 것이 Cas13 기반 분자진단을 이해하는 다음 단계입니다.

※ 이 글은 CRISPR-Cas13 기반 핵산 검출과 reporter 판독 원리를 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다. 특정 검사제품의 성능 평가나 개인의 검사 결과 해석을 위한 의료정보가 아닙니다.