CRISPR Cas13은 RNA를 어떻게 찾아낼까? 표적 인식과 Collateral Cleavage 원리

Cas13은 DNA가 아니라 RNA를 표적으로 삼는 CRISPR-associated protein입니다. 원하는 RNA를 인식하면 RNase 활성이 활성화되고 주변 RNA까지 절단할 수 있습니다. 이 독특한 반응이 어떻게 RNA 검출 신호로 바뀌는지 알아보겠습니다.

DNA가 아닌 RNA를 찾는 CRISPR 시스템

CRISPR-Cas 기술이라고 하면 Cas9처럼 DNA를 절단하는 유전자 가위를 먼저 떠올리기 쉽습니다.

Cas13 계열은 출발점부터 다릅니다.

대표적인 Cas13 단백질은 RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector로, crRNA의 안내를 받아 상보적인 single-stranded RNA(ssRNA)​를 인식할 수 있습니다.

Cas13a가 처음 C2c2라는 이름으로 연구되던 당시에도 RNA-guided RNase라는 독특한 특성이 주목받았습니다.

즉, Cas13을 이해하는 첫 번째 핵심은 DNA를 자르는 또 하나의 Cas 단백질이 아니라 RNA 정보를 읽고 RNA를 절단할 수 있는 CRISPR 시스템이라는 점입니다.

Cas13과 crRNA가 하나의 RNA 탐색기를 만든다

Cas13이 원하는 RNA를 혼자 구별하는 것은 아닙니다.

Cas13은 crRNA(CRISPR RNA)​와 결합하여 표적을 탐색하는 복합체를 형성합니다.

crRNA에는 Cas13과 상호작용하는 부분과 표적 RNA를 찾아내는 spacer 영역이 포함됩니다.

Spacer가 분석하려는 RNA의 특정 영역과 상보적으로 결합할 수 있도록 설계하면 Cas13-crRNA complex가 해당 RNA를 선택적으로 인식할 수 있습니다.

따라서 원하는 RNA 표적이 바뀌었을 때 항상 Cas13 단백질 자체를 새롭게 만드는 것이 아니라 crRNA의 표적 인식 서열을 변경하여 다른 RNA를 찾도록 프로그램할 수 있다는 것이 CRISPR 기반 검출의 중요한 특징입니다.

표적 RNA가 결합하면 Cas13의 상태가 달라진다

Cas13 기반 검출에서 흥미로운 일은 정확한 표적 RNA가 crRNA와 결합한 다음에 일어납니다.

표적 RNA와 crRNA 사이에 적절한 상보적 결합이 형성되면 Cas13의 RNase 활성이 활성화됩니다.

대표적인 Cas13 단백질에는 RNA 절단과 관련된 HEPN(Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide-binding) domain​이 존재합니다.

Cas13의 두 HEPN 영역에 존재하는 촉매 잔기들이 활성 부위를 구성하여 RNA 절단에 관여합니다.

즉, 표적 RNA는 단순히 잡히는 분석 대상에 그치지 않습니다.

Cas13의 RNase 기능을 켜는 molecular trigger 역할도 하는 셈입니다.

표적을 찾은 뒤 주변 RNA까지 절단한다

활성화된 Cas13의 가장 잘 알려진 특징 가운데 하나가 collateral cleavage입니다.

Cas13-crRNA complex는 상보적인 표적 RNA를 인식한 뒤 다른 주변의 single-stranded RNA substrate도 절단할 수 있습니다.

여기서 두 종류의 인식을 구분하는 것이 중요합니다.

첫 번째는 sequence-specific target recognition입니다.

어떤 RNA가 Cas13을 활성화할지는 crRNA와의 상보성에 의해 결정됩니다.

두 번째는 활성화 이후 나타나는 collateral RNA cleavage입니다.

이 단계에서는 처음 Cas13을 활성화시킨 표적 RNA와 동일한 서열만 자르는 것이 아니라 주변의 다른 ssRNA substrate도 절단할 수 있습니다.

따라서 반응을 개념적으로 표현하면 다음과 같습니다.

Target RNA 인식 → Cas13 활성화 → 주변 ssRNA 절단

분자진단 연구에서는 바로 이 두 번째 반응을 신호 발생에 이용할 수 있습니다.

무작위 RNA 절단이 어떻게 측정 가능한 신호가 될까?

Cas13이 주변 RNA를 절단한다는 사실만으로는 분석 결과를 쉽게 읽을 수 없습니다.

그래서 연구자들은 Cas13이 자를 수 있는 인공적인 RNA reporter를 반응액에 추가합니다.

대표적인 형광 reporter는 짧은 RNA의 양쪽에 fluorophore와 quencher를 배치한 구조입니다.

Reporter가 온전하면 두 물질이 가까워 형광이 억제됩니다.

표적 RNA가 존재하면 Cas13이 활성화되고 reporter RNA가 절단됩니다.

절단으로 fluorophore와 quencher가 분리되면서 형광신호가 증가합니다.

결국 측정되는 신호는 다음 관계를 갖습니다.

표적 RNA 존재
↓
Cas13-crRNA 활성화
↓
RNA Reporter 절단
↓
형광 증가

따라서 Cas13은 RNA 서열을 인식하는 분자 센서와 그 인식 결과를 신호로 전환하는 효소의 역할을 동시에 수행할 수 있습니다.

Cas13과 Cas12는 무엇을 자르는지가 다르다

Cas13을 공부하다 보면 바로 앞에서 살펴본 Cas12a와 상당히 비슷하게 느껴집니다.

둘 모두 crRNA를 이용해 특정 핵산을 인식하고, 표적 인식 이후 collateral/trans-cleavage를 검출에 활용할 수 있기 때문입니다.

하지만 분석 대상과 reporter가 다릅니다.

구분	Cas12a	Cas13 계열
대표적인 표적	DNA	RNA
Guide	crRNA	crRNA
대표적인 collateral substrate	ssDNA	ssRNA
형광 Reporter	주로 ssDNA	주로 ssRNA
대표 진단 플랫폼	DETECTR	SHERLOCK
핵심 특징	DNA 인식→ssDNA cleavage	RNA 인식→ssRNA cleavage

이 표만 보면 Cas12=DNA, Cas13=RNA라고 간단히 외울 수 있지만 실제 CRISPR-Cas 시스템은 더 복잡합니다.

Cas12와 Cas13에도 여러 subtype과 ortholog가 존재하며 표적 인식 조건, cleavage preference와 collateral activity 등이 서로 다를 수 있습니다.

따라서 특정 Cas 단백질을 이용해 assay를 설계할 때는 해당 effector의 특성을 개별적으로 확인해야 합니다.

Cas13에는 Cas9의 PAM과 같은 조건이 있을까?

Cas9이나 Cas12a로 이중가닥 DNA를 표적화할 때 자주 등장하는 개념이 PAM입니다.

Cas13은 RNA를 표적으로 하기 때문에 Cas9에서 이야기하는 DNA PAM을 동일하게 적용하지 않습니다.

다만 일부 Cas13 시스템에서는 표적 RNA 주변의 특정 염기에 영향을 받는 PFS(Protospacer Flanking Site) 조건이 보고됐습니다.

예를 들어 초기 LshCas13a 연구에서는 특정 PFS 선호가 관찰됐습니다.

하지만 이것 역시 모든 Cas13 단백질에 동일하게 적용되는 절대적인 규칙은 아닙니다.

Cas13 subtype과 ortholog에 따라 PFS 요구조건이나 표적 제약이 달라질 수 있기 때문에 Cas13은 특정 PFS가 반드시 필요하다고 일반화하는 것도 피해야 합니다.

RNA 하나를 찾는데 왜 핵산 증폭이 필요할까?

Cas13이 원하는 RNA를 직접 인식할 수 있다면 별도의 증폭 과정이 왜 필요할까요?

실제 검체에서 표적 RNA의 농도가 매우 낮을 수 있기 때문입니다.

Cas13의 collateral cleavage가 신호 발생에 도움을 주지만 매우 적은 양의 표적을 항상 충분한 분석신호로 변환할 수 있는 것은 아닙니다.

그래서 Cas13 앞단에 pre-amplification 단계를 연결하는 전략이 많이 연구됐습니다.

여기서 중요한 것은 Cas13이 최종적으로 인식할 수 있는 형태가 RNA라는 점입니다.

증폭산물이 DNA라면 T7 RNA polymerase를 이용한 in vitro transcription 단계를 추가하여 Cas13이 인식할 RNA를 만들어낼 수 있습니다.

따라서 RPA처럼 DNA를 만드는 증폭법도 적절한 transcription 설계를 추가하면 Cas13 시스템과 연결할 수 있습니다.

RPA도 Cas13과 함께 사용할 수 있다

원문의 RPA와 LAMP는 DNA를 생성하므로 Cas12와 사용하고 NASBA는 RNA를 생성하므로 Cas13과 사용한다는 구분은 지나치게 단순합니다.

실제로 대표적인 Cas13 기반 진단 기술인 SHERLOCK에서는 RPA와 T7 transcription을 Cas13 검출에 연결하는 전략이 사용됐습니다.

개념적으로 보면 다음과 같습니다.

Target nucleic acid → RPA → T7 transcription → RNA → Cas13 activation → Reporter cleavage

RPA에서 만들어진 DNA에 T7 promoter가 포함되도록 설계하면 T7 RNA polymerase가 이를 RNA로 전사할 수 있습니다.

그 RNA를 Cas13이 인식하는 것입니다.

따라서 핵산 증폭 기술과 CRISPR effector의 조합은 DNA 증폭법은 Cas12, RNA 증폭법은 Cas13이라는 고정된 규칙보다 증폭산물을 최종 Cas 단백질이 인식할 수 있는 형태로 어떻게 연결하는가가 더 중요합니다.

SHERLOCK은 Cas13을 어떻게 이용했을까?

Cas13 기반 분자진단에서 빼놓기 어려운 이름이 SHERLOCK입니다.

SHERLOCK은 Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing의 약자입니다.

2017년 발표된 대표적인 연구에서는 RPA와 T7 transcription, Cas13a의 collateral RNase activity를 연결하여 핵산 검출 플랫폼을 구성했습니다.

먼저 표적 핵산을 증폭하고, 증폭된 DNA 정보를 RNA로 전사한 뒤 Cas13a-crRNA complex가 원하는 RNA 서열을 확인합니다.

표적이 맞으면 Cas13a가 활성화되고 RNA reporter를 절단하여 검출신호를 발생시킵니다.

각각의 기술이 역할을 나눠 가진다는 것이 중요합니다.

• RPA: 표적 정보 증폭
• T7 RNA polymerase: DNA 정보를 RNA로 변환
• Cas13-crRNA: 원하는 RNA 서열 확인
• Collateral cleavage: Reporter 절단
• Reporter: 형광 등의 측정 가능한 신호 생성

Cas13 자체가 표적 RNA를 수백만 개 복제하는 것은 아닙니다.

증폭과 표적 인식, 신호 발생을 서로 다른 분자 반응으로 연결한 시스템​입니다.

Cas13의 Collateral Cleavage는 항상 장점일까?

Collateral cleavage는 Cas13 기반 분자진단에서는 매우 유용한 특성입니다.

하지만 생명체의 세포 안에서 Cas13을 사용하는 경우에는 이야기가 달라질 수 있습니다.

표적 RNA를 인식한 Cas13이 주변 RNA까지 광범위하게 절단한다면 의도하지 않은 생물학적 효과가 나타날 가능성을 고려해야 하기 때문입니다.

또한 Cas13 subtype과 사용 환경에 따라 collateral activity의 정도가 다르게 나타날 수 있습니다.

따라서 시험관 내 분자진단에서 reporter를 절단하는 용도와 세포 안에서 특정 RNA를 조절하는 용도를 동일한 관점으로 평가하면 안 됩니다.

Cas13을 진단과 치료에 모두 좋은 기술이라고 단순화하기보다 어떤 Cas13 effector를 어떤 환경에서 어떤 목적으로 사용하는지에 따라 요구되는 특성이 달라진다고 보는 것이 적절합니다.

Cas13의 핵심은 RNA를 발견하면 RNase가 켜진다는 것

Cas13의 복잡한 구조를 모두 기억하지 않아도 핵심 메커니즘은 비교적 명확합니다.

먼저 crRNA가 어떤 RNA를 찾을지 지정합니다.

Cas13-crRNA complex가 상보적인 표적 RNA를 발견하면 Cas13의 RNase 기능이 활성화됩니다.

활성화된 Cas13은 표적과 관련된 절단뿐 아니라 주변의 ssRNA substrate에 collateral cleavage를 일으킬 수 있습니다.

연구자들은 이 반응에 인공적인 RNA reporter를 넣어 RNA의 존재 여부를 측정 가능한 신호로 변환했습니다.

따라서 Cas13 기반 분자진단의 핵심은 다음과 같이 정리할 수 있습니다.

RNA 서열 인식 → Cas13 활성화 → Collateral RNA cleavage → Reporter 신호 발생

Cas12a가 DNA 인식을 ssDNA reporter 신호로 바꾸는 데 활용된다면 Cas13은 RNA 정보를 RNA reporter의 절단으로 읽어낼 수 있다는 점에서 차이가 있습니다.

이 원리를 이해하면 SHERLOCK을 비롯한 CRISPR 기반 RNA 검출 기술에서 Cas13이 담당하는 역할도 명확하게 구분할 수 있습니다.

※ 본문은 CRISPR-Cas13의 분자생물학적 원리와 분자진단 활용을 설명하기 위한 교육용 콘텐츠입니다. 특정 진단검사의 성능이나 개인의 검사 결과를 해석하기 위한 의료정보가 아닙니다.