NASBA 원리, RNA를 다시 RNA로 증폭하는 등온 핵산 증폭 기술

NASBA는 RNA를 출발점으로 삼아 최종적으로 많은 RNA 증폭산물을 만드는 독특한 등온증폭 기술입니다. Reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase가 차례로 작동하는 이유를 따라가면 증폭 원리를 쉽게 이해할 수 있습니다.

NASBA는 왜 RNA 증폭 기술로 분류될까?

NASBA는 Nucleic Acid Sequence-Based Amplification의 약자로, 1990년대 초부터 연구된 등온 핵산 증폭 기술입니다.

LAMP나 RPA를 공부한 뒤 NASBA를 보면 가장 먼저 눈에 띄는 차이가 있습니다.

LAMP와 RPA에서는 DNA 합성이 증폭의 중심이라면 NASBA에서는 RNA → DNA → RNA로 이어지는 전사 과정이 증폭 회로의 중심입니다.

반응 도중 cDNA와 이중가닥 DNA도 만들어지지만 최종적으로 크게 축적되는 주요 증폭산물은 단일가닥 RNA입니다.

이 때문에 NASBA는 특히 RNA 표적 분석과 밀접하게 연결되어 발전해 왔습니다.

세 효소가 역할을 나눠 가진다

NASBA 반응은 일반적으로 세 종류의 효소에 의존합니다.

• Reverse transcriptase
• RNase H
• T7 RNA polymerase

이 세 효소는 동일한 일을 반복하는 것이 아닙니다.

Reverse transcriptase는 RNA를 이용해 DNA를 만들고 이후 DNA 가닥 합성에도 관여합니다.

RNase H는 RNA-DNA hybrid에 존재하는 RNA 가닥을 분해합니다.

T7 RNA polymerase는 T7 promoter가 포함된 이중가닥 DNA를 인식하여 많은 RNA transcript를 만들어냅니다.

이를 간단히 정리하면 RNA를 DNA로 바꾸고 → RNA를 제거하고 → 전사 가능한 DNA를 만든 다음 → 다시 많은 RNA를 생산하는 시스템입니다.

첫 번째 Primer에는 특별한 서열이 붙어 있다

NASBA는 기본적으로 두 개의 표적 특이적 primer를 이용합니다.

하지만 두 primer의 역할은 완전히 같지 않습니다.

첫 번째 primer에는 표적 RNA와 결합하는 서열뿐 아니라 T7 RNA polymerase가 인식할 수 있는 promoter 서열이 포함됩니다.

이 T7 promoter가 NASBA의 증폭 방향을 결정하는 핵심 장치입니다.

표적 RNA가 존재하면 promoter가 포함된 primer가 RNA에 결합하고 reverse transcriptase가 이를 연장하여 cDNA를 합성합니다.

그 결과 처음에는 다음과 같은 hybrid가 만들어집니다.

표적 RNA + 새롭게 만들어진 cDNA

이 단계에서는 아직 본격적인 RNA 증폭이 시작된 것이 아닙니다.

T7 RNA polymerase가 작동할 수 있는 이중가닥 promoter 구조를 만드는 준비 단계라고 볼 수 있습니다.

RNase H가 RNA를 제거하는 이유

Reverse transcription이 끝나면 RNA와 DNA가 서로 결합된 RNA-DNA hybrid가 존재합니다.

여기서 RNase H가 등장합니다.

RNase H는 RNA-DNA hybrid 안에 존재하는 RNA 가닥을 선택적으로 분해할 수 있습니다.

원래 표적 RNA가 제거되면 단일가닥 cDNA가 남습니다.

이 과정이 중요한 이유는 다음 primer가 cDNA에 결합할 수 있는 상태를 만들어주기 때문입니다.

즉, RNase H의 역할은 프라이머를 직접 붙이는 것이 아니라 RNA-DNA hybrid에서 RNA를 제거하여 다음 DNA 합성이 가능한 구조를 만드는 것입니다.

두 번째 DNA 가닥이 만들어지면 T7 promoter가 완성된다

RNA가 제거된 단일가닥 cDNA에는 두 번째 primer가 결합할 수 있습니다.

Reverse transcriptase가 이 primer를 연장하면 두 번째 DNA 가닥이 만들어지고 결국 이중가닥 DNA가 형성됩니다.

여기서 매우 중요한 변화가 생깁니다.

첫 번째 primer에 포함되어 있던 T7 promoter 서열 역시 이중가닥 구조를 갖게 됩니다.

T7 RNA polymerase는 바로 이 double-stranded T7 promoter를 인식할 수 있습니다.

따라서 NASBA의 초기 과정은 단순히 RNA를 DNA로 바꾸는 것이 목적이 아니라, T7 RNA polymerase가 사용할 수 있는 transcription template를 만드는 과정이라고 이해할 수 있습니다.

하나의 DNA에서 많은 RNA가 만들어진다

T7 promoter가 완성되면 반응의 성격이 크게 달라집니다.

T7 RNA polymerase가 promoter를 인식한 뒤 DNA template를 따라 RNA를 전사합니다.

DNA polymerase가 한 번 연장해 DNA 한 가닥을 만드는 것과 달리 RNA polymerase는 하나의 DNA template에서 반복적으로 많은 RNA transcript를 만들어낼 수 있습니다.

따라서 하나의 transcription-competent DNA에서 다수의 RNA가 생성됩니다.

초기 표적 RNA와 비교하면 이 RNA들은 반대 방향의 서열, 즉 antisense RNA가 될 수 있습니다.

NASBA에서 높은 증폭량을 얻을 수 있는 이유 중 하나가 바로 이 전사에 의한 다중 RNA 생산입니다. 초기 NASBA 연구에서도 반응 후 특정 단일가닥 RNA가 주요 산물로 크게 축적되는 것이 보고됐습니다.

새롭게 생성된 RNA가 다시 증폭 회로에 들어간다

NASBA가 단순한 RNA transcription과 다른 이유는 여기에서 나타납니다.

T7 RNA polymerase가 만들어낸 RNA가 최종산물로 끝나는 것이 아닙니다.

이 RNA 역시 다른 primer가 결합할 수 있는 새로운 template 역할을 합니다.

Primer 결합 이후 reverse transcriptase가 cDNA를 합성하고, RNase H가 RNA를 제거한 뒤 다른 primer와 reverse transcriptase가 다시 이중가닥 DNA를 형성합니다.

새로운 이중가닥 DNA에도 T7 promoter가 만들어집니다.

T7 RNA polymerase는 다시 여기에서 많은 RNA를 전사합니다.

결국 반응은 다음처럼 연결됩니다.

표적 RNA → cDNA → T7 promoter를 가진 dsDNA → 다수 RNA → 새로운 cDNA → 새로운 dsDNA → 더 많은 RNA

이 순환이 반복되면서 RNA 신호가 빠르게 증가합니다.

NASBA는 왜 약 41℃에서 반응할까?

NASBA의 본격적인 증폭 반응은 전통적으로 약 41℃의 일정한 온도에서 수행됩니다.

PCR처럼 95℃, 60℃, 72℃ 등의 온도를 계속 오갈 필요가 없습니다.

그 이유는 NASBA에서 생성되는 주요 증폭산물이 단일가닥 RNA이고, 세 효소의 연속적인 작용으로 반응이 이어지기 때문입니다.

다만 NASBA는 가열 과정이 전혀 필요 없다고 설명하는 것도 정확하지 않습니다.

많은 NASBA protocol에서는 증폭을 시작하기 전에 RNA의 secondary structure를 풀어 primer 접근성을 높이기 위해 약 65℃에서 짧게 가열한 뒤 41℃로 낮추는 단계를 사용합니다. 이후 실제 증폭 반응은 일정한 온도에서 진행됩니다.

따라서 thermal cycling은 필요하지 않지만 초기 전처리 가열이 사용될 수 있다고 구분하는 편이 정확합니다.

NASBA가 RNA 표적에 잘 맞는 이유

NASBA의 반응 구조는 처음부터 RNA를 처리하도록 만들어져 있습니다.

Reverse transcriptase가 반응계 안에 포함돼 있기 때문에 RNA를 먼저 별도의 PCR용 cDNA로 만들어 놓은 뒤 다른 증폭 시스템으로 옮기는 방식과 다릅니다.

RNA를 입력으로 넣으면 reverse transcription과 transcription-driven amplification이 하나의 반응 체계 안에서 이어집니다.

특히 DNA와 RNA가 함께 존재하는 검체에서 특정 RNA를 분석하려는 경우 NASBA의 특성이 활용될 수 있습니다.

41℃ 조건에서는 일반적인 이중가닥 DNA가 PCR에서처럼 열변성되지 않기 때문에 RNA 표적에 대한 선택성을 활용하는 연구도 이루어져 왔습니다.

그렇다고 모든 RNA 분석에서 NASBA가 RT-qPCR보다 우수하다는 의미는 아닙니다.

목적에 따라 검출 성능, 정량성, 시약 구성, 장비, 검체 전처리 및 assay 검증 결과를 함께 고려해야 합니다.

NASBA와 RT-PCR은 무엇이 다를까?

두 기술 모두 RNA 분석에 활용될 수 있지만 증폭 구조는 상당히 다릅니다.

구분	RT-PCR 계열	NASBA
초기 표적	RNA	주로 RNA
초기 과정	RNA를 cDNA로 변환	RNA를 cDNA로 변환
주요 증폭 방식	DNA polymerase 기반 PCR	T7 RNA polymerase 기반 transcription cycle
온도 제어	Thermal cycling 필요	증폭 단계는 약 41℃ 등온
주요 증폭산물	DNA	다량의 single-stranded RNA
주요 효소	RT + DNA polymerase 등	RT + RNase H + T7 RNA polymerase

가장 중요한 차이는 무엇을 반복적으로 생산하느냐입니다.

RT-PCR에서는 cDNA를 기반으로 DNA를 반복 증폭하지만 NASBA에서는 transcription-capable DNA를 만든 뒤 RNA를 대량 생산하고 그 RNA가 다시 증폭 과정에 참여합니다.

생성된 RNA는 어떻게 검출할까?

NASBA에서 만들어진 단일가닥 RNA는 여러 방식으로 검출할 수 있습니다.

대표적으로 complementary probe를 이용한 hybridization 기반 검출이 가능합니다.

Molecular beacon과 같은 형광 probe도 NASBA와 함께 사용돼 왔습니다. Molecular beacon은 특정 RNA 서열과 결합하면 구조가 변하면서 형광 신호가 증가하도록 설계할 수 있습니다.

또 최근 연구에서는 NASBA에서 만들어진 RNA를 다른 biosensor와 연결하기도 합니다.

예를 들면 CRISPR 기반 검출이나 toehold switch와 같은 RNA-responsive sensor와 NASBA를 결합하는 연구가 이루어지고 있습니다. 최근 POCT 관련 리뷰에서도 이러한 통합 플랫폼이 소개되고 있습니다.

NASBA가 RNA를 최종산물로 만든다는 특징이 단순한 차이점을 넘어 후단 RNA sensing 기술과 결합하기 좋은 특성으로도 이어지는 것입니다.

세 가지 효소를 동시에 조율해야 하는 것이 과제다

NASBA는 별도의 thermal cycling 없이 높은 수준의 RNA 증폭을 구현할 수 있다는 장점이 있지만 반응계 자체는 결코 단순하지 않습니다.

Reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase 세 효소가 같은 반응 환경 안에서 제대로 작동해야 합니다.

각 효소의 활성뿐 아니라 primer 설계, Mg²⁺ 농도, RNA 구조, 검체에 존재하는 inhibitor 등의 영향을 함께 받을 수 있습니다.

생물학적 검체를 사용하면 추출과 전처리 방식 역시 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

최근 POCT 연구에서도 NASBA의 multi-enzyme reaction이 현장 적용을 위해 최적화해야 할 요소 가운데 하나로 지적되고 있습니다.

따라서 NASBA의 한계를 단순히 시약 가격이 비싸다고 설명하기보다는 여러 효소가 동시에 작동해야 하는 반응 복잡성, 시료 전처리, 검출 시스템 통합과 assay 최적화가 실용화에서 중요한 과제​라고 설명하는 것이 더 적절합니다.

NASBA의 핵심은 RNA가 증폭 회로의 입력이자 출력이라는 점

NASBA를 이해하는 가장 좋은 방법은 세 효소의 이름을 외우는 것이 아닙니다.

RNA가 어떤 형태로 바뀌고 다시 어떻게 RNA로 돌아오는지를 따라가는 것입니다.

Reverse transcriptase가 RNA 정보를 DNA로 옮기고, RNase H가 원래 RNA를 제거합니다. 두 번째 DNA 가닥이 만들어져 T7 promoter가 완성되면 T7 RNA polymerase가 많은 새로운 RNA를 생산합니다.

그 RNA들은 다시 새로운 증폭 cycle을 시작할 수 있습니다.

즉, NASBA의 핵심은 RNA → DNA 중간체 → 대량의 RNA → 다시 증폭이라는 transcription-driven feedback입니다.

이러한 구조 때문에 NASBA는 LAMP의 loop 증폭이나 RPA의 recombinase-driven strand invasion, EXPAR의 nicking-trigger cycle과는 전혀 다른 방식으로 등온 핵산 증폭을 구현합니다.

※ 본문은 NASBA의 분자생물학적 원리를 이해하기 위한 교육용 콘텐츠입니다. 특정 진단검사의 성능이나 개인의 검사 결과를 해석하기 위한 의료정보가 아닙니다.