HDST 원리: 2μm 위치 바코드 비드로 조직의 RNA를 분석하는 고해상도 공간 전사체 기술

조직의 유전자 발현을 세밀하게 분석하려면 RNA의 양뿐 아니라 위치도 알아야 합니다. HDST는 약 2μm 크기의 위치 바코드 비드를 이용해 조직 절편에서 RNA를 포획하는 기술입니다. 높은 공간 해상도를 구현하는 원리와 RNA 검출 민감도의 한계를 알아봅니다.

1. 공간 전사체 분석에서 해상도가 중요한 이유

조직은 서로 다른 기능을 가진 세포들이 밀접하게 배열된 구조입니다.

예를 들어 뇌 조직에는 신경세포와 신경교세포가 존재하며, 각각의 세포는 고유한 유전자 발현 특성을 나타냅니다.

종양 조직에서도 암세포와 면역세포, 섬유아세포가 서로 다른 위치에 분포합니다.

이러한 세포를 구분하려면 유전자 발현량뿐 아니라 RNA가 검출된 위치를 확인해야 합니다.

일반적인 RNA-seq에서는 조직에서 RNA를 추출하기 때문에 공간적 위치 정보가 사라질 수 있습니다.

공간 전사체 분석은 이러한 문제를 해결하기 위해 개발됐습니다.

다만 분석 지점의 크기가 크면 여러 세포에서 유래한 RNA가 하나의 측정값으로 합쳐질 수 있습니다.

따라서 공간 해상도를 높이면 서로 가까운 세포와 조직 구조를 더 세밀하게 구분할 가능성이 커집니다.

HDST는 이러한 목적을 위해 개발된 비드 기반 공간 전사체 분석 기술입니다.

2. HDST는 어떤 기술일까?

HDST는 High-Definition Spatial Transcriptomics의 약자입니다.

한국어로는 고해상도 공간 전사체 분석 기술이라고 설명할 수 있습니다.

2019년 Vickovic와 연구진은 Nature Methods에 HDST의 원리와 활용 결과를 발표했습니다.

이 기술은 약 2μm 크기의 미세 비드를 조밀하게 배열한 표면에서 RNA를 포획합니다.

각 비드에는 위치를 구별할 수 있는 DNA 바코드가 부착돼 있습니다.

조직 절편을 비드 표면에 올린 뒤 RNA를 포획하고 시퀀싱하면 특정 RNA가 어느 비드에 포획됐는지 확인할 수 있습니다.

이후 비드의 위치 정보를 이용해 조직 내 유전자 발현 지도를 구성합니다.

원천 연구에서는 약 2μm 공간 해상도로 생쥐 뇌 조직과 사람 유방암 조직을 분석했습니다. <Cite refs={[“turn828886search0″,”turn828886search1”]}/>

3. HDST의 핵심은 2μm 크기의 비드 배열

HDST는 미세 비드를 육각형 구조의 작은 홈에 배열합니다.

2019년 원천 연구에서는 140만 개가 넘는 약 2μm 크기의 홈을 가진 배열을 제작했습니다.

각 홈에는 DNA 바코드가 부착된 비드가 배치됩니다.

비드는 무작위로 배열되므로 바코드만으로 실제 위치를 알 수 없습니다.

따라서 RNA를 포획하기 전에 각 비드의 바코드와 위치를 연결하는 과정이 필요합니다.

이렇게 구성된 비드 배열은 조직의 넓은 영역에서 RNA를 포획할 수 있습니다.

원천 연구에서는 수십만 개의 위치 바코드와 RNA 정보를 연결해 공간적 발현을 분석했습니다.

그러나 배열에 존재하는 모든 비드에서 RNA가 검출되는 것은 아닙니다.

일부 비드는 조직과 접촉하지 않거나 RNA 포획에 실패할 수 있기 때문입니다.

4. Spatial Barcode는 어떤 역할을 할까?

Spatial Barcode는 RNA가 포획된 비드를 식별하는 DNA 서열입니다.

각 비드에는 서로 다른 바코드가 부여됩니다.

예를 들어 비드 A에는 Barcode A가, 비드 B에는 Barcode B가 부착될 수 있습니다.

RNA가 비드 A에 포획되면 이후 생성되는 cDNA에 Barcode A의 정보가 연결됩니다.

시퀀싱 결과에서 Barcode A가 확인되면 해당 RNA가 비드 A에 포획됐다는 사실을 알 수 있습니다.

그러나 Barcode A라는 서열 자체가 조직의 위치를 의미하지는 않습니다.

비드 A가 배열의 어느 위치에 존재하는지 미리 기록해야 합니다.

따라서 HDST에서는 바코드 서열과 비드 좌표를 연결하는 과정이 필수적입니다.

5. HDST에서 비드의 위치를 판독하는 방법

HDST에서는 반복적인 형광 혼성화를 이용해 비드의 바코드를 판독합니다.

각 비드에는 서로 다른 DNA 바코드가 부착돼 있습니다.

형광 probe를 이용해 바코드의 일부 정보를 읽고, 여러 차례의 혼성화와 영상 촬영을 반복합니다.

이후 각 비드에서 관찰된 형광 신호를 조합해 바코드를 식별합니다.

이 과정에서는 오류 교정 전략을 이용해 바코드 판독의 정확도를 높일 수 있습니다.

바코드가 확인되면 현미경 영상에서 해당 비드의 좌표를 기록합니다.

이렇게 만든 바코드와 좌표의 대응 정보는 RNA 시퀀싱 결과를 공간적으로 배치하는 데 사용됩니다.

따라서 비드 위치 판독에 오류가 발생하면 RNA의 공간적 위치도 잘못 표시될 수 있습니다.

6. HDST의 RNA 포획 원리

HDST 비드에는 Poly(dT) 서열을 포함한 oligonucleotide가 부착돼 있습니다.

Poly(dT)는 Poly(A) tail을 가진 RNA에 결합할 수 있습니다.

조직 절편을 비드 배열 위에 올리고 RNA가 방출되도록 처리하면 RNA가 주변 비드에 포획됩니다.

이때 RNA는 원래 조직 위치와 가까운 비드에 포획될 가능성이 있습니다.

이후 역전사 반응을 통해 RNA를 cDNA로 변환합니다.

cDNA에는 비드의 Spatial Barcode 정보가 연결됩니다.

따라서 시퀀싱 결과를 이용해 RNA의 종류와 포획 위치를 함께 확인할 수 있습니다.

그러나 RNA가 조직에서 방출되는 동안 확산될 수 있습니다.

따라서 비드의 좌표가 원래 RNA 분자의 정확한 세포 내 위치와 완전히 일치하는 것은 아닙니다.

7. HDST의 대표적인 실험 과정

HDST 분석은 일반적으로 다음과 같은 단계로 구성됩니다.

① DNA 바코드가 부착된 미세 비드를 배열합니다.

② 반복적인 형광 혼성화로 비드의 바코드와 좌표를 기록합니다.

③ 신선 동결 조직 절편을 비드 배열 위에 올립니다.

④ 조직을 염색하고 현미경으로 형태학적 영상을 촬영합니다.

⑤ 조직을 투과화해 RNA가 비드에 포획되도록 처리합니다.

⑥ 포획된 RNA를 cDNA로 역전사합니다.

⑦ 시퀀싱 라이브러리를 제작하고 NGS를 수행합니다.

⑧ Spatial Barcode를 이용해 RNA 발현을 비드 좌표에 배치합니다.

이 과정에서 조직의 형태학적 영상과 RNA 발현 정보를 연결할 수 있습니다.

따라서 특정 유전자가 조직의 어느 구조에서 많이 검출되는지 분석할 수 있습니다.

8. 2μm 해상도는 무엇을 의미할까?

HDST의 대표적인 공간 해상도는 약 2μm입니다.

이는 RNA를 포획하는 개별 비드 배열의 크기와 관련이 있습니다.

그러나 2μm 해상도가 RNA 분자의 정확한 위치를 2μm 오차 없이 측정한다는 의미는 아닙니다.

RNA는 조직에서 방출된 뒤 주변 비드로 이동할 수 있습니다.

또한 하나의 세포가 여러 비드에 걸쳐 존재할 수 있습니다.

반대로 세포 경계에 가까운 비드에서는 서로 다른 세포에서 유래한 RNA가 함께 포획될 수 있습니다.

따라서 HDST의 공간 해상도는 비드 배열의 측정 단위와 관련된 개념입니다.

실제 RNA의 위치 정확도는 조직 처리와 RNA 확산, 영상 정합 조건에 영향을 받습니다.

9. HDST와 Slide-seq의 공간 해상도 비교

HDST와 Slide-seq는 모두 DNA 바코드가 부착된 미세 비드를 이용합니다.

그러나 비드 크기와 배열 방식에 차이가 있습니다.

비교 항목	HDST	Slide-seq
대표 원천 연구	Vickovic et al., 2019	Rodriques et al., 2019
공간 해상도	약 2μm	약 10μm
비드 배열	육각형 미세 홈에 비드 배치	표면에 비드를 조밀하게 배열
RNA 포획	Poly(dT) 기반	Poly(dT) 기반
분석 방법	RNA 포획 후 NGS	RNA 포획 후 NGS
주요 제한	낮은 비드당 RNA 검출량	RNA 포획 효율과 위치 오차

HDST는 Slide-seq보다 작은 측정 단위를 제공합니다.

그러나 공간 해상도가 높다고 해서 모든 유전자에 대한 검출 성능이 더 좋은 것은 아닙니다.

비드 크기가 작아지면 하나의 비드가 포획할 수 있는 RNA의 양이 제한될 수 있기 때문입니다.

따라서 두 기술을 비교할 때는 공간 해상도와 RNA 검출 민감도를 함께 고려해야 합니다.

10. HDST의 초기 연구에서 확인된 RNA 포획 효율

2019년 원천 연구에서는 HDST의 RNA 포획 효율을 평가했습니다.

연구진은 생쥐 뇌 조직에서 세 가지 유전자에 대한 smFISH 결과와 HDST 결과를 비교했습니다.

비교한 유전자는 Penk, Slc17a7, Fabp7입니다.

그 결과 HDST의 비드당 RNA 포획 효율을 약 1.3%로 추정했습니다.

이 수치는 HDST가 높은 공간 해상도를 제공하지만 초기 구현에서는 RNA 검출 민감도가 제한적이었다는 점을 보여줍니다.

다만 1.3%는 해당 연구에서 특정 유전자와 검체를 이용해 추정한 값입니다.

모든 RNA와 조직에서 동일한 포획 효율이 나타난다는 의미는 아닙니다.

또한 이 값은 HDST의 모든 실험 단계에서 발생하는 오류를 하나의 수치로 표현한 것이 아닙니다. <Cite ref=”turn828886search5″/>

11. 비드당 RNA 검출량이 적으면 어떤 문제가 발생할까?

HDST에서는 하나의 비드에서 검출되는 RNA 수가 적을 수 있습니다.

예를 들어 특정 비드에서 RNA가 두 개만 검출됐다고 가정하겠습니다.

이 경우 해당 위치의 세포가 실제로 두 개의 RNA만 발현했다고 해석해서는 안 됩니다.

RNA가 충분히 포획되지 않았거나 시퀀싱 과정에서 일부 분자가 검출되지 않았을 수 있기 때문입니다.

특히 발현량이 낮은 유전자는 검출되지 않을 가능성이 있습니다.

이러한 현상은 Dropout이라고 부릅니다.

Dropout이 많으면 개별 비드의 유전자 발현 특성을 이용해 세포 종류를 분류하기 어려워집니다.

따라서 HDST에서는 주변 비드의 정보를 결합해 분석하는 방법을 사용할 수 있습니다.

12. Binning은 무엇을 의미할까?

Binning은 여러 비드의 RNA 검출 결과를 하나의 분석 단위로 합치는 방법입니다.

예를 들어 특정 비드에서 RNA가 세 개만 검출됐다고 가정하겠습니다.

주변 비드에서도 각각 몇 개의 RNA만 검출됐다면 개별 비드의 발현 정보를 이용하기 어렵습니다.

이때 주변 비드의 RNA 정보를 합치면 더 많은 RNA를 이용해 발현 특성을 분석할 수 있습니다.

2019년 HDST 연구에서도 주변 비드의 정보를 결합하는 방법을 사용했습니다.

연구진은 5배 수준으로 묶은 분석 단위에서 평균 44.4개의 UMI가 검출됐다고 보고했습니다.

표준편차는 30.6개였습니다.

이는 여러 비드의 정보를 결합하면 RNA 검출량을 높일 수 있음을 보여줍니다.

그러나 Binning을 수행하면 개별 비드 수준의 공간적 세부 정보가 감소할 수 있습니다.

따라서 Binning은 RNA 검출량과 공간 해상도 사이의 절충 방법으로 이해해야 합니다. <Cite ref=”turn828886search5″/>

13. Binning을 많이 하면 항상 좋은 결과가 나올까?

그렇지는 않습니다.

Binning을 많이 하면 하나의 분석 단위에 포함되는 RNA 수가 증가할 수 있습니다.

따라서 저발현 유전자를 검출하거나 세포 종류를 추정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

그러나 서로 다른 세포에서 유래한 RNA가 하나의 분석 단위로 합쳐질 가능성도 커집니다.

예를 들어 종양세포와 면역세포가 인접한 영역에서 Binning을 수행한다고 가정하겠습니다.

여러 비드를 하나로 합치면 종양세포와 면역세포의 RNA가 혼합될 수 있습니다.

이 경우 두 세포 집단의 발현 특성을 구별하기 어려워질 수 있습니다.

따라서 Binning 범위는 분석 목적과 조직의 세포 밀도에 맞춰 설정해야 합니다.

특히 세포 경계가 중요한 분석에서는 과도한 Binning을 피해야 합니다.

14. HDST에서 조직 염색 영상이 중요한 이유

HDST는 RNA 발현 정보뿐 아니라 조직의 형태학적 영상도 활용합니다.

2019년 원천 연구에서는 조직을 H&E로 염색한 뒤 영상을 촬영했습니다.

H&E 염색은 세포핵과 세포질, 조직 구조를 구별하는 데 도움이 됩니다.

이후 RNA 발현 정보를 조직 영상과 연결하면 특정 유전자가 어느 형태학적 영역에서 많이 검출되는지 확인할 수 있습니다.

예를 들어 뇌 조직에서는 서로 다른 층과 영역을 구별할 수 있습니다.

종양 조직에서는 암세포가 밀집된 영역과 주변 조직을 구분할 수 있습니다.

그러나 형태학적 영상만으로 모든 세포 종류를 정확하게 구별할 수는 없습니다.

따라서 세포 종류를 추정할 때는 조직 영상과 유전자 발현 정보를 함께 활용하는 것이 중요합니다.

15. 2019년 원천 연구의 생쥐 뇌 분석

Vickovic와 연구진은 HDST를 이용해 생쥐의 후각망울을 분석했습니다.

후각망울은 여러 층으로 구성된 뇌 조직입니다.

연구진은 H&E 염색 영상에서 서로 다른 형태학적 층을 구분했습니다.

이후 HDST의 RNA 발현 정보를 이용해 각 층에서 상대적으로 많이 발현되는 유전자를 분석했습니다.

또한 단일세포 RNA-seq 참조 자료를 이용해 세포 종류별 발현 특성을 비교했습니다.

이러한 결과는 HDST가 조직의 형태학적 구조와 유전자 발현 정보를 연결할 수 있음을 보여줍니다.

그러나 세포 종류의 추정 결과는 참조 데이터와 분석 방법의 영향을 받습니다.

따라서 특정 비드가 하나의 세포 종류에 해당한다고 단정해서는 안 됩니다.

16. 사람 유방암 조직에서는 무엇을 분석했을까?

2019년 원천 연구에서는 사람의 원발성 유방암 조직도 분석했습니다.

연구진은 HDST를 이용해 종양 조직의 RNA 발현을 공간적으로 측정했습니다.

또한 형태학적 영상과 유전자 발현 정보를 연결해 서로 다른 조직 영역의 특성을 비교했습니다.

이러한 분석은 종양 조직 내부의 이질성을 이해하는 데 도움이 됩니다.

예를 들어 종양세포가 밀집된 영역과 주변 기질세포 영역에서 서로 다른 유전자 발현 특성이 나타날 수 있습니다.

그러나 특정 유전자가 종양 영역에서 많이 검출됐다는 사실만으로 해당 유전자가 종양 발생의 원인이라고 확정할 수는 없습니다.

또한 RNA 발현량이 높다고 해서 단백질 발현이나 기능이 동일한 수준으로 증가했다고 단정할 수 없습니다.

따라서 분자병리학적 해석에는 다른 검사 결과와의 비교가 필요합니다.

17. 가상의 HDST 데이터 해석 사례

종양 조직에서 네 개의 비드 영역을 분석했다고 가정하겠습니다.

유전자	영역 A	영역 B	영역 C	영역 D
Gene 1	18	15	2	3
Gene 2	3	4	20	17
Gene 3	5	6	7	8
Gene 4	12	11	10	9

표의 숫자는 여러 비드를 결합한 분석 단위에서 검출된 UMI 수를 가정한 값입니다.

이 결과에서는 Gene 1이 영역 A와 B에서 상대적으로 많이 검출됩니다.

반면 Gene 2는 영역 C와 D에서 상대적으로 많이 검출됩니다.

이러한 차이는 서로 다른 조직 영역의 유전자 발현 특성을 비교하는 데 도움이 될 수 있습니다.

그러나 특정 유전자의 검출 수가 높다는 이유만으로 해당 영역의 세포 종류를 확정할 수는 없습니다.

여러 유전자의 발현 조합과 조직 영상, 참조 데이터를 함께 분석해야 합니다.

이 표는 분석 원리를 설명하기 위한 가상 사례입니다.

18. HDST에서 위양성 위치 정보가 발생하는 이유

HDST는 비드의 위치와 RNA 시퀀싱 결과를 연결합니다.

그러나 이 과정에서 위치 정보가 부정확하게 표시될 수 있습니다.

비드 바코드 판독 오류

비드의 바코드가 잘못 판독되면 RNA가 다른 위치에 배정될 수 있습니다.

RNA 확산

조직에서 방출된 RNA가 주변 비드로 이동하면 원래 위치와 다른 좌표에서 검출될 수 있습니다.

영상 정합 오류

조직의 형태학적 영상과 비드 배열의 좌표가 정확하게 정렬되지 않으면 RNA 발현 위치가 잘못 표시될 수 있습니다.

라이브러리 오염

검체 또는 라이브러리 사이의 오염이 발생하면 실제로 존재하지 않는 RNA 신호가 나타날 수 있습니다.

따라서 HDST에서는 비드 바코드와 조직 영상, RNA 라이브러리의 품질을 함께 관리해야 합니다.

19. HDST에서 RNA가 검출되지 않는 이유

특정 비드에서 RNA가 검출되지 않았다고 해서 해당 위치의 세포가 RNA를 발현하지 않는다고 확정할 수는 없습니다.

RNA가 충분히 포획되지 않았을 수 있습니다.

또한 RNA가 손상됐거나 역전사 효율이 낮았을 수 있습니다.

시퀀싱 깊이가 충분하지 않으면 저발현 유전자가 검출되지 않을 수도 있습니다.

특히 HDST는 작은 비드를 사용하기 때문에 개별 비드에서 검출되는 RNA 수가 적을 수 있습니다.

따라서 음성 결과를 해석할 때는 비드별 UMI 수와 검출 유전자 수를 함께 확인해야 합니다.

또한 주변 비드의 발현 정보와 조직 영상도 참고해야 합니다.

20. HDST와 다른 공간 전사체 기술의 차이

HDST는 공간 해상도를 높이기 위해 작은 비드를 사용하는 기술입니다.

그러나 공간 전사체 분석 기술은 각각 다른 장점과 제한을 가지고 있습니다.

비교 항목	HDST	Slide-seq	MERFISH
핵심 원리	2μm 비드와 NGS	10μm 비드와 NGS	반복 형광 영상과 바코드
RNA 분석	포획 후 시퀀싱	포획 후 시퀀싱	조직 내 직접 영상 분석
유전자 선택	사전 유전자별 probe 패널 불필요	사전 유전자별 probe 패널 불필요	사전 probe 패널 필요
공간 해상도	약 2μm	약 10μm	영상 조건에 따라 다름
주요 장점	매우 작은 공간 측정 단위	비교적 넓은 영역의 공간 분석	RNA 분자 위치의 영상 기반 분석
주요 제한	낮은 비드당 RNA 검출량	RNA 포획 효율과 위치 오차	반복 영상과 바코드 판독 오류

HDST는 비드 기반 RNA 포획 기술 가운데 높은 공간 해상도를 제공하는 초기 기술 중 하나입니다.

그러나 공간 해상도만으로 기술의 우수성을 판단해서는 안 됩니다.

RNA 검출 민감도와 분석 면적, 검체 적합성, 실험 비용도 함께 고려해야 합니다.

21. HDST의 분자진단적 활용 가능성

HDST는 조직의 유전자 발현과 공간적 구조를 연결할 수 있습니다.

따라서 종양 조직에서 암세포와 면역세포, 기질세포의 발현 특성을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

또한 정상 조직과 질환 조직 사이에서 유전자 발현의 공간적 차이를 분석할 수 있습니다.

이러한 정보는 질환 관련 바이오마커를 탐색하는 데 도움이 됩니다.

그러나 HDST에서 특정 발현 패턴이 관찰됐다는 사실만으로 질환을 확정할 수는 없습니다.

임상 검사로 활용하려면 검체 처리와 RNA 포획 효율, 비드 위치 판독, 시퀀싱 및 판정 기준에 대한 검증이 필요합니다.

따라서 HDST는 일반적인 확진 검사보다는 공간 전사체 연구와 바이오마커 탐색을 위한 기술로 이해하는 것이 적절합니다.

22. HDST의 분석적 가치와 한계

HDST는 약 2μm 크기의 위치 바코드 비드를 이용해 조직의 RNA 발현을 공간적으로 분석하는 기술입니다.

2019년 원천 연구에서는 생쥐 뇌 조직과 사람 유방암 조직에서 RNA 발현과 형태학적 정보를 연결했습니다.

또한 수십만 개의 위치 바코드를 이용해 높은 공간 해상도의 유전자 발현 지도를 구성할 수 있음을 제시했습니다.

그러나 초기 HDST에서는 비드당 RNA 포획 효율이 제한적이었습니다.

연구진은 smFISH와의 비교에서 약 1.3%의 포획 효율을 추정했습니다.

따라서 개별 비드의 RNA 검출량이 적을 경우 주변 비드의 정보를 결합하는 Binning이 필요할 수 있습니다.

하지만 Binning을 많이 수행하면 공간적 세부 정보가 감소할 수 있습니다.

따라서 HDST에서는 공간 해상도와 RNA 검출 민감도 사이의 관계를 고려해야 합니다.

HDST의 핵심적인 가치는 매우 작은 비드 배열을 이용해 조직의 유전자 발현을 세밀한 공간 좌표와 연결할 수 있다는 점입니다.

이는 조직 내부의 세포 구성과 유전자 발현 특성을 연구하는 데 중요한 정보를 제공하지만, 높은 공간 해상도가 반드시 높은 RNA 검출 민감도를 의미하는 것은 아닙니다.

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참고문헌

1. Vickovic S, Eraslan G, Salmén F, et al. (2019).

High-definition spatial transcriptomics for in situ tissue profiling.

Nature Methods, 16, 987–990.

DOI: https://doi.org/10.1038/s41592-019-0548-y

약 2μm 크기의 위치 바코드 비드를 이용해 생쥐 뇌와 사람 유방암 조직의 RNA 발현을 분석한 HDST 원천 연구입니다.

2. Vickovic S, et al. (2019). 원천 연구 공개 전문.

PubMed Central: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6765407/

HDST의 비드 배열과 바코드 위치 판독, RNA 포획 효율, Binning 및 조직 분석 결과를 확인할 수 있습니다.

3. Broad Institute. High-definition spatial transcriptomics for in situ tissue profiling.

https://www.broadinstitute.org/publications/broad613071

HDST 원천 연구의 연구진과 논문 정보를 확인할 수 있는 기관 자료입니다.

4. HDST 공개 데이터. Single Cell Portal, Study SCP420.

https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP420/hdst

HDST 연구에서 생성된 공간 전사체 데이터와 관련 자료를 확인할 수 있는 공개 데이터 페이지입니다.

※ 본 글은 공개된 학술논문을 바탕으로 HDST의 원리와 연구 활용을 설명한 교육용 콘텐츠입니다. 원천 연구에서 보고된 공간 해상도와 RNA 포획 효율은 해당 실험 조건에 관한 결과이며, 모든 검체에서 동일한 성능이 보장되는 것은 아닙니다.