Capture-C 원리: 멀리 떨어진 DNA 조절 영역을 선택적으로 찾아내는 방법

유전자 발현은 유전자 바로 앞의 서열만으로 결정되지 않습니다. 수십만 염기쌍 떨어진 조절 영역도 유전자와 접촉할 수 있습니다. Capture-C는 특정 DNA 구간과 연결된 염색질 접촉을 선택적으로 농축해 이러한 관계를 분석하는 기술입니다.

1. 유전자에서 멀리 떨어진 변이가 발현에 영향을 주는 이유

유전체 분석에서 발견되는 변이가 모두 단백질의 아미노산 서열을 바꾸는 것은 아닙니다.

상당수 변이는 유전자 사이의 비암호화 영역이나 유전자 내부의 조절 영역에 존재합니다.

이러한 변이는 단백질 서열을 직접 바꾸지 않더라도 유전자 발현에 영향을 줄 수 있습니다.

대표적인 예가 enhancer입니다.

Enhancer는 특정 유전자의 전사를 조절하는 DNA 서열로, 조절 대상 유전자의 promoter에서 멀리 떨어져 존재할 수 있습니다.

DNA가 세포핵 안에서 접히면 enhancer와 promoter가 공간적으로 가까워질 수 있습니다.

따라서 유전자에서 수십만 염기쌍 떨어진 위치에 변이가 발생하더라도 해당 유전자의 발현 조절에 영향을 줄 가능성이 있습니다.

문제는 어떤 enhancer가 실제로 어떤 유전자와 접촉하는지 확인하는 것입니다.

단순히 유전체상에서 가장 가까운 유전자를 조절 대상으로 지정하면 잘못된 결론에 도달할 수 있습니다.

Capture-C는 특정 유전자 주변의 염색질 접촉을 선택적으로 분석해 이러한 문제를 연구하는 데 활용됩니다.

2. Capture-C는 Hi-C와 어떤 원리가 다를까?

Capture-C와 Hi-C는 모두 Chromosome Conformation Capture(3C) 계열의 기술입니다.

두 기술은 공간적으로 가까운 DNA 조각을 연결한다는 공통점이 있습니다.

하지만 최종적으로 분석하는 DNA 조각의 범위가 다릅니다.

Hi-C는 유전체 전반의 DNA 접촉을 분석하도록 설계된 기술입니다.

반면 Capture-C는 연구자가 미리 선택한 DNA 구간을 중심으로 접촉 정보를 농축합니다.

예를 들어 특정 질환과 관련된 유전자 20개의 promoter를 분석한다고 가정하겠습니다.

Hi-C에서는 유전체 전체에서 발생한 접촉을 폭넓게 수집합니다.

Capture-C에서는 선택한 promoter를 포함하는 DNA 조각과 연결된 접촉 정보를 집중적으로 분석할 수 있습니다.

이러한 표적 농축은 제한된 시퀀싱 자원을 관심 영역에 집중하는 데 도움이 됩니다.

다만 Capture-C는 표적으로 선택하지 않은 DNA 구간 사이의 접촉을 포괄적으로 분석하는 데 적합하지 않습니다.

3. Capture-C에서 DNA 접촉 정보가 만들어지는 과정

Capture-C 분석은 일반적으로 3C 라이브러리 제작과 표적 농축 과정으로 구성됩니다.

먼저 세포를 고정해 DNA와 단백질 사이의 공간적 관계를 보존합니다.

이후 제한효소로 DNA를 절단하고 공간적으로 가까운 DNA 말단을 연결합니다.

이 과정을 거치면 원래 유전체상에서 멀리 떨어져 있던 두 DNA 구간이 하나의 DNA 분자로 연결될 수 있습니다.

그다음 연결된 DNA를 정제하고 시퀀싱 라이브러리를 제작합니다.

여기까지는 3C 계열 기술과 기본적인 원리가 비슷합니다.

Capture-C에서는 여기에 표적 DNA 조각을 선택적으로 회수하는 hybridization capture 과정을 추가합니다.

이 과정이 Capture-C를 구별하는 핵심입니다.

4. 표적 농축에 사용하는 Oligonucleotide Probe의 역할

Capture-C에서는 분석하려는 유전체 구간에 상보적으로 결합하는 oligonucleotide probe를 설계합니다.

이러한 probe는 일반적으로 biotin으로 표지할 수 있습니다.

Probe를 3C 라이브러리와 반응시키면 표적 DNA 구간을 포함하는 라이브러리 조각에 결합합니다.

이후 streptavidin이 결합된 자성 비드를 이용해 biotin 표지 probe와 결합한 DNA를 회수할 수 있습니다.

여기서 중요한 점은 표적 DNA만 단독으로 회수하는 것이 아니라는 사실입니다.

표적 DNA와 다른 DNA 구간이 ligation으로 연결돼 있다면 그 연결 정보도 함께 회수할 수 있습니다.

예를 들어 promoter A와 enhancer B가 연결된 DNA 조각이 존재한다고 가정하겠습니다.

Promoter A를 인식하는 probe를 이용하면 promoter A뿐 아니라 연결된 enhancer B의 서열도 함께 분석할 수 있습니다.

이러한 방식으로 특정 promoter와 접촉하는 원거리 DNA 구간을 탐색합니다.

Probe가 결합했다고 해서 실제 접촉이 입증될까?

그렇지는 않습니다.

Probe는 표적 DNA 서열을 농축하는 역할을 합니다.

실제 접촉 여부는 앞선 3C 과정에서 생성된 ligation 산물과 후속 시퀀싱 결과를 바탕으로 평가합니다.

또한 비특이적 결합이나 무작위 ligation 산물이 포함될 수 있으므로 적절한 데이터 필터링이 필요합니다.

5. 2014년 원천 연구에서 확인한 Capture-C의 특징

2014년 Hughes와 연구진은 Nature Genetics에 Capture-C 기술을 발표했습니다.

연구진은 기존 3C 기술의 표적 수와 분석 효율을 개선하기 위해 고처리량 표적 농축 방법을 개발했습니다.

이 연구에서는 하나의 실험에서 수백 개의 관심 유전체 영역을 고해상도로 분석할 수 있음을 제시했습니다.

또한 α-globin 유전자와 관련된 조절 영역의 접촉을 분석했습니다.

α-globin은 헤모글로빈을 구성하는 단백질의 일부를 암호화하는 유전자입니다.

이 유전자의 발현은 여러 원거리 조절 요소의 영향을 받습니다.

연구진은 Capture-C를 이용해 α-globin promoter 주변의 접촉 패턴을 분석하고 조절 영역과의 관계를 평가했습니다.

이 결과는 Capture-C가 특정 유전자 주변의 조절 영역을 선택적으로 조사하는 데 유용하다는 점을 보여줍니다.

다만 접촉이 관찰됐다는 사실만으로 해당 조절 영역이 유전자 발현을 직접 증가시키거나 감소시킨다고 확정할 수는 없습니다.

기능적 영향을 판단하려면 유전자 발현 분석과 조절 영역의 기능 검증이 필요합니다.

6. NG Capture-C는 기존 방법에서 무엇을 개선했을까?

2016년 Davies와 연구진은 Nature Methods에 Next Generation Capture-C(NG Capture-C)를 발표했습니다.

NG Capture-C는 표적 농축과 라이브러리 설계 등을 개선해 분석 감도와 재현성을 높인 방법입니다.

연구진은 여러 유전체 위치와 검체를 동시에 분석할 수 있도록 기술을 개선했습니다.

또한 적은 수의 세포에서도 고해상도 접촉 분석이 가능하다는 점을 제시했습니다.

해당 연구에서는 10만 개 수준의 세포를 이용해 고해상도 접촉 데이터를 생성할 수 있음을 보고했습니다.

이는 특정 유전자 주변의 접촉을 분석하기 위해 반드시 대량의 세포가 필요한 것은 아니라는 가능성을 보여줍니다.

그러나 10만 개 세포가 모든 NG Capture-C 실험에서 충분하다는 의미는 아닙니다.

표적 수와 세포 종류, 라이브러리 복잡도, 필요한 분석 해상도에 따라 요구되는 세포 수가 달라질 수 있습니다.

7. Capture-C에서 접촉 빈도는 어떻게 계산할까?

Capture-C 결과에서는 특정 표적 구간과 연결된 DNA 조각의 read 수를 측정할 수 있습니다.

예를 들어 promoter A를 표적으로 분석했다고 가정하겠습니다.

세 개의 원거리 DNA 구간에서 다음과 같은 유효 접촉 read가 관찰됐습니다.

접촉 구간	유효 접촉 read 수	전체 1,000개 중 비율
Enhancer 후보 B	500	50%
조절 영역 후보 C	300	30%
비암호화 영역 D	200	20%

이 결과에서는 B 구간과 연결된 read가 가장 많습니다.

하지만 B 구간이 C 구간보다 정확히 1.67배 가까운 거리에 존재한다는 의미는 아닙니다.

또한 B 구간이 반드시 가장 강력한 enhancer라는 의미도 아닙니다.

접촉 read 수는 제한효소 절단 효율과 라이브러리 제작 과정, 표적 농축 효율, DNA 조각 길이 등의 영향을 받습니다.

따라서 단순한 read 수 비교만으로 접촉 강도나 조절 기능을 확정해서는 안 됩니다.

이 표는 계산 원리를 설명하기 위한 가상 사례이며 실제 연구 결과가 아닙니다.

8. 접촉 read 수가 많아도 조절 기능을 확정할 수 없는 이유

Capture-C는 DNA 구간 사이의 접촉을 측정합니다.

하지만 접촉이 관찰됐다는 사실과 유전자 발현을 직접 조절한다는 사실은 서로 다릅니다.

예를 들어 특정 enhancer 후보가 promoter와 자주 접촉한다고 가정하겠습니다.

이러한 접촉은 유전자 발현 조절과 관련될 수 있습니다.

그러나 해당 DNA 구간이 실제로 enhancer 기능을 수행하는지 확인하려면 추가적인 근거가 필요합니다.

대표적으로 다음과 같은 자료를 활용할 수 있습니다.

• RNA-seq을 이용한 유전자 발현 분석
• ATAC-seq을 이용한 염색질 접근성 분석
• ChIP-seq을 이용한 전사인자 또는 히스톤 표지 분석
• CRISPR 기반 조절 영역 교란 실험

특히 조절 영역을 제거하거나 억제했을 때 표적 유전자의 발현이 달라지는지 확인하면 기능적 관계를 평가하는 데 도움이 됩니다.

따라서 Capture-C는 조절 영역과 표적 유전자 사이의 후보 관계를 제시하는 기술로 이해하는 것이 적절합니다.

9. SNP가 원거리 유전자 발현에 영향을 주는지 분석하는 방법

유전체 연관성 연구(GWAS)에서는 특정 질환과 통계적으로 연관된 SNP를 발견할 수 있습니다.

하지만 GWAS에서 발견된 SNP가 어떤 유전자에 영향을 주는지는 별도의 분석이 필요합니다.

특히 SNP가 비암호화 영역에 존재하는 경우에는 가까운 유전자만으로 기능을 추정하기 어렵습니다.

Capture-C는 이러한 상황에서 활용할 수 있습니다.

예를 들어 질환 관련 SNP가 특정 enhancer 후보 영역에 존재한다고 가정하겠습니다.

해당 영역이 유전자 A보다 유전자 B의 promoter와 더 자주 접촉한다면 유전자 B가 조절 대상 후보일 수 있습니다.

하지만 이것만으로 SNP가 유전자 B의 발현을 변화시킨다고 확정할 수는 없습니다.

SNP가 실제로 조절 영역의 기능을 변화시키는지 확인해야 합니다.

또한 접촉 패턴은 세포 종류에 따라 달라질 수 있습니다.

따라서 질환과 관련된 조직 또는 세포에서 얻은 자료를 사용하는 것이 중요합니다.

10. Allele-specific Capture-C는 무엇을 분석할까?

일반적인 Capture-C는 여러 세포와 상동염색체에서 얻은 접촉 정보를 함께 분석합니다.

하지만 특정 SNP가 존재하는 경우 두 상동염색체를 구분해 접촉을 분석할 수 있습니다.

이를 allele-specific Capture-C라고 합니다.

예를 들어 한 상동염색체에는 정상 대립유전자가 있고 다른 상동염색체에는 변이 대립유전자가 있다고 가정하겠습니다.

이때 두 대립유전자의 접촉 패턴이 다르게 나타나는지 비교할 수 있습니다.

2016년 NG Capture-C 연구에서는 SNP 정보를 이용해 대립유전자별 접촉 패턴을 분석할 수 있음을 제시했습니다.

이러한 분석은 특정 변이가 유전체의 공간적 접촉에 영향을 주는지 연구하는 데 도움이 됩니다.

다만 allele-specific 분석에는 충분한 informative SNP와 시퀀싱 read가 필요합니다.

또한 reference allele에 더 잘 정렬되는 편향이 발생할 수 있으므로 주의해야 합니다.

11. Capture-C와 3C·4C·Hi-C의 차이

염색질 접촉을 분석하는 기술은 여러 종류가 있습니다.

각 기술은 분석하려는 DNA 구간의 범위와 필요한 시퀀싱 깊이, 분석 목적이 다릅니다.

기술	주요 분석 범위	특징
3C	특정 두 구간	미리 정한 접촉을 확인
4C	한 표적과 다수 구간	하나의 관찰 지점을 중심으로 접촉 탐색
Hi-C	유전체 전체	전반적인 염색질 접촉 지도 제작
Capture-C	여러 선택 표적과 접촉 상대	관심 영역의 접촉 정보 농축
Promoter Capture Hi-C	다수 promoter 중심	promoter 관련 접촉을 광범위하게 분석

2017년 Davies와 연구진은 Nature Methods에 발표한 검토 논문에서 이러한 기술들이 해상도와 재현성, 처리량, 분석 편향 측면에서 서로 다르다고 설명했습니다.

따라서 어떤 기술이 가장 우수한지 일률적으로 판단하기 어렵습니다.

유전체 전체의 공간적 조직을 분석하려면 Hi-C가 적합할 수 있습니다.

반면 특정 유전자 주변의 조절 영역을 자세하게 분석하려면 Capture-C가 효율적인 선택이 될 수 있습니다.

12. Promoter Capture Hi-C와 Capture-C는 같은 기술일까?

Promoter Capture Hi-C(PCHi-C)는 promoter와 연결된 DNA 접촉을 선택적으로 농축하는 기술입니다.

일반적인 Capture-C와 표적 농축이라는 공통점을 가지고 있습니다.

그러나 PCHi-C는 일반적으로 Hi-C 라이브러리를 제작한 뒤 promoter를 포함하는 DNA 조각을 선택적으로 농축하는 방식으로 수행됩니다.

반면 원래의 Capture-C는 3C 라이브러리를 기반으로 여러 표적 구간의 접촉을 분석하도록 개발됐습니다.

따라서 두 기술을 완전히 동일한 실험법으로 취급해서는 안 됩니다.

2015년 Schoenfelder와 연구진은 생쥐 배아줄기세포와 태아 간세포에서 22,000개 이상의 promoter를 대상으로 접촉 분석을 수행했습니다.

이 연구는 다수의 promoter와 원거리 조절 영역 사이의 관계를 분석하는 데 표적 농축 기술이 활용될 수 있음을 보여줍니다.

그러나 분석 결과는 해당 세포의 염색질 상태를 반영합니다.

다른 세포 종류에서도 동일한 접촉 패턴이 나타난다고 가정해서는 안 됩니다.

13. Capture-C에서 발생할 수 있는 위양성 원인

Capture-C는 표적 농축을 이용하지만 모든 접촉 신호가 실제 생물학적 관계를 의미하는 것은 아닙니다.

대표적인 오류 원인은 다음과 같습니다.

무작위 Ligation

DNA 조각이 실제로 안정적인 공간적 접촉을 형성하지 않았더라도 실험 과정에서 연결될 수 있습니다.

이러한 산물은 배경 신호로 나타날 수 있습니다.

Probe의 비특이적 결합

Probe가 의도하지 않은 DNA 서열에 결합하면 표적이 아닌 DNA 조각이 농축될 수 있습니다.

특히 반복서열이 많은 영역에서는 probe 설계에 주의해야 합니다.

제한효소 절단 편향

DNA 구간마다 제한효소 인식 위치와 절단 효율이 다를 수 있습니다.

따라서 특정 구간의 접촉 read 수가 실제 접촉 빈도와 다르게 나타날 수 있습니다.

PCR 중복

하나의 ligation 산물에서 여러 PCR 복제본이 생성되면 독립적인 접촉 사건의 수를 과대평가할 수 있습니다.

따라서 중복 read를 적절하게 처리해야 합니다.

14. Capture-C 결과를 해석할 때 확인해야 할 사항

Capture-C는 특정 유전자 주변의 접촉 정보를 자세하게 분석할 수 있지만, 결과의 신뢰성은 실험 조건과 데이터 처리 방법에 영향을 받습니다.

특히 다음 사항을 확인하는 것이 중요합니다.

1. 표적 Probe 설계: 관심 유전자 영역을 적절하게 포함하는지 확인합니다.
2. 라이브러리 복잡도: 충분한 수의 독립적인 ligation 산물이 확보됐는지 평가합니다.
3. PCR 중복률: 중복 read가 접촉 빈도 계산에 영향을 주는지 확인합니다.
4. 생물학적 반복: 서로 다른 검체에서도 접촉 패턴이 재현되는지 평가합니다.
5. 세포 종류: 분석한 접촉이 연구 대상 질환과 관련된 세포에서 관찰됐는지 확인합니다.

특히 세포 종류는 중요한 변수입니다.

같은 유전자라도 세포의 분화 상태와 전사 활성에 따라 주변 조절 영역과의 접촉 패턴이 달라질 수 있습니다.

따라서 특정 세포에서 관찰한 Capture-C 결과를 다른 조직에 그대로 적용해서는 안 됩니다.

15. Capture-C의 분자진단적 활용 가능성

Capture-C는 현재 특정 유전자 변이를 직접 판정하는 일반적인 임상 검사보다 유전자 조절 기전을 연구하는 분야에서 활용됩니다.

특히 비암호화 영역의 변이가 어떤 유전자에 영향을 줄 수 있는지 분석하는 데 유용합니다.

예를 들어 GWAS에서 질환과 연관된 SNP가 발견됐지만 표적 유전자가 불분명한 경우를 생각할 수 있습니다.

Capture-C는 해당 SNP가 위치한 조절 영역과 접촉하는 유전자 promoter를 탐색하는 데 도움이 됩니다.

또한 암에서 특정 조절 영역의 재배열이 유전자 발현에 영향을 주는지 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

그러나 Capture-C 결과만으로 특정 SNP가 질환의 원인이라고 확정할 수는 없습니다.

질환과의 인과관계를 판단하려면 유전자 발현과 조절 기능, 임상적 연관성에 대한 추가 검증이 필요합니다.

16. Capture-C가 제공하는 핵심 정보

Capture-C는 유전체 전체를 균일하게 분석하는 대신 관심 DNA 구간의 접촉 정보를 선택적으로 농축하는 기술입니다.

2014년 원천 연구에서는 수백 개의 유전체 영역을 동시에 분석할 수 있음을 제시했습니다.

2016년 NG Capture-C 연구에서는 분석 감도와 재현성을 개선하고, 10만 개 수준의 세포에서도 고해상도 접촉 분석이 가능하다는 점을 보여줬습니다.

또한 SNP 정보를 이용해 대립유전자별 접촉 패턴을 분석할 수 있음을 확인했습니다.

이러한 특징은 비암호화 변이와 원거리 유전자 조절 관계를 연구하는 데 중요한 정보를 제공합니다.

그러나 Capture-C에서 관찰된 접촉은 유전자 발현 조절의 직접적인 증거와 동일하지 않습니다.

따라서 RNA-seq과 ATAC-seq, 기능적 유전자 교란 실험 등과 함께 해석하는 것이 적절합니다.

Capture-C의 핵심적인 가치는 특정 유전자 주변의 DNA 접촉을 선택적으로 농축해 원거리 조절 영역과의 관계를 자세하게 분석할 수 있다는 점입니다.

이는 염기서열 분석만으로 확인하기 어려운 유전자 조절 관계를 이해하는 데 도움이 되지만, 특정 질환의 원인을 단독으로 확정하는 기술과는 구별해야 합니다.

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참고문헌

1. Hughes JR, Roberts N, McGowan S, et al. (2014).

Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment.

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Capture-C 기술을 제시하고 여러 유전체 영역의 원거리 조절 접촉을 고해상도로 분석한 원천 연구입니다.

2. Davies JOJ, Telenius JM, McGowan SJ, et al. (2016).

Multiplexed analysis of chromosome conformation at vastly improved sensitivity.

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DOI: https://doi.org/10.1038/nmeth.3664

NG Capture-C의 개선된 분석 감도와 재현성, 다중 표적 분석 및 대립유전자별 접촉 분석을 설명한 연구입니다.

3. Schoenfelder S, Furlan-Magaril M, Mifsud B, et al. (2015).

The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.

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DOI: https://doi.org/10.1101/gr.185272.114

생쥐 배아줄기세포와 태아 간세포에서 다수의 promoter와 원거리 조절 영역 사이의 접촉을 분석한 연구입니다.

4. Davies JOJ, Oudelaar AM, Higgs DR, Hughes JR. (2017).

How best to identify chromosomal interactions: a comparison of approaches.

Nature Methods, 14, 125–134.

DOI: https://doi.org/10.1038/nmeth.4146

3C 계열 기술의 해상도와 재현성, 처리량, 분석 편향을 비교한 검토 논문입니다.

5. Schoenfelder S, Javierre BM, Furlan-Magaril M, Wingett SW, Fraser P. (2018).

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions.

Journal of Visualized Experiments, 136, 57320.

DOI: https://doi.org/10.3791/57320

Promoter Capture Hi-C의 실험 원리와 promoter 관련 접촉 영역을 분석하는 방법을 설명한 프로토콜입니다.

※ 본 글은 공개된 학술논문을 바탕으로 Capture-C의 원리와 연구 활용을 설명한 교육용 콘텐츠입니다. 특정 DNA 구간의 접촉이 관찰됐다는 사실만으로 유전자 발현 조절이나 질환과의 인과관계를 확정해서는 안 됩니다.