분자진단 PCR이란? DNA 증폭 원리부터 디지털 PCR까지

코로나19 팬데믹을 거치면서 PCR(Polymerase Chain Reaction)은 연구자나 의료인뿐 아니라 일반인에게도 익숙한 용어가 되었습니다. 하지만 PCR이 정확히 무엇을 검사하는 기술인지, 작은 양의 유전물질을 어떻게 찾아내는지까지 이해하는 경우는 많지 않습니다.

PCR의 핵심은 특정 DNA 영역을 선택적으로 증폭하는 데 있습니다. 분석하려는 유전물질이 매우 적더라도 원하는 부분을 반복해서 복제하면 검출과 분석이 가능한 수준까지 늘릴 수 있습니다.

최근에는 이러한 PCR의 기본 원리를 발전시켜 시료를 수많은 작은 반응 공간으로 나누어 분석하는 디지털 PCR(dPCR)도 활용되고 있습니다.

이번 글에서는 분자진단의 기본 개념부터 PCR의 세 단계, 기존 PCR과 디지털 PCR의 차이까지 차례로 살펴보겠습니다.

분자진단이란 무엇일까?

분자진단(Molecular Diagnostics)은 검체에 존재하는 DNA나 RNA 등의 분자적 특징을 분석하여 필요한 정보를 얻는 체외진단 분야의 한 영역입니다.

감염성 질환과 관련된 병원체의 핵산을 검출하거나 특정 유전적 변이를 확인하는 것 등이 대표적인 활용 사례입니다. 분석 목적에 따라 PCR뿐 아니라 염기서열분석과 같은 다양한 기술이 이용됩니다.

여기서 중요한 것은 분자진단 자체가 하나의 검사법을 의미하는 것은 아니라는 점입니다.

분자진단이라는 큰 범주 안에 PCR, 실시간 PCR, 디지털 PCR, 염기서열분석 등 여러 분석 기술이 존재한다고 이해하면 쉽습니다.

PCR이 널리 이용되는 이유 중 하나는 극소량으로 존재하는 특정 핵산 서열을 선택적으로 증폭할 수 있기 때문입니다.

PCR은 DNA를 어떻게 증폭할까?

PCR은 Polymerase Chain Reaction의 약자로 우리말로는 중합효소연쇄반응이라고 합니다.

분석하려는 DNA와 프라이머(primer), DNA 중합효소(polymerase), 뉴클레오타이드 등의 구성요소를 이용하여 특정 DNA 영역을 반복적으로 복제합니다.

이 과정에서 특히 중요한 것이 프라이머입니다.

프라이머는 증폭하려는 DNA 영역의 양쪽에 결합하도록 설계되는 짧은 핵산 서열입니다. Forward primer와 Reverse primer 한 쌍을 이용함으로써 어느 DNA 영역을 증폭할 것인지 결정할 수 있습니다.

PCR 반응은 크게 세 단계로 이해할 수 있습니다.

1. 변성(Denaturation)

DNA는 일반적으로 두 가닥이 서로 결합한 이중가닥 구조를 가지고 있습니다.

PCR에서는 먼저 높은 온도를 가해 두 가닥 사이의 결합을 풀어 각각의 단일가닥으로 분리합니다. 흔히 약 95℃ 부근의 온도가 사용되지만 실제 조건은 사용하는 효소와 분석법에 따라 달라질 수 있습니다.

2. 결합(Annealing)

온도를 낮추면 미리 설계한 프라이머가 상보적인 DNA 서열에 결합합니다.

Annealing 온도는 항상 55℃로 정해져 있는 것이 아닙니다. 프라이머의 길이와 염기조성, 설계 조건 등에 따라 적절한 온도가 달라집니다.

따라서 PCR에서 프라이머 설계와 반응 조건의 설정은 결과에 영향을 주는 중요한 요소입니다.

3. 신장(Extension)

프라이머가 DNA에 결합하면 DNA 중합효소가 프라이머를 시작점으로 새로운 DNA 가닥을 합성합니다.

전통적으로 많이 사용되는 Taq DNA polymerase의 경우 약 72℃에서 신장 단계를 수행하는 경우가 많습니다.

이러한 변성 → 결합 → 신장 과정을 여러 사이클 반복하면 목표로 설정한 DNA 영역이 크게 증가합니다.

즉, PCR의 본질은 DNA 전체를 무작정 늘리는 것이 아니라 프라이머로 지정한 특정 DNA 영역을 선택적으로 증폭하는 것에 있습니다.

RNA는 PCR로 어떻게 검사할까?

여기에서 한 가지 의문이 생길 수 있습니다.

PCR의 기본적인 증폭 대상은 DNA인데 RNA를 유전물질로 사용하는 바이러스는 어떻게 분석할 수 있을까요?

이때 이용되는 것이 역전사(Reverse Transcription) 과정입니다.

RNA를 그대로 DNA polymerase로 증폭하는 것이 아니라 먼저 역전사효소를 이용해 RNA 정보를 상보적 DNA(cDNA)로 변환합니다. 이후 생성된 cDNA를 PCR로 증폭할 수 있습니다.

이를 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)​이라고 합니다.

여기서 RT-PCR과 Real-time PCR을 같은 용어로 생각하면 혼동하기 쉽습니다. RT는 일반적으로 Reverse Transcription을 의미하며, Real-time PCR은 증폭 과정에서 발생하는 형광 신호를 실시간으로 측정하는 방식입니다.

따라서 목적에 따라 역전사와 실시간 검출을 결합한 real-time RT-PCR도 사용될 수 있습니다.

일반 PCR과 Real-time PCR의 차이

전통적인 PCR에서는 증폭 반응이 끝난 다음 생성된 산물을 별도의 방법으로 확인할 수 있습니다.

반면 Real-time PCR, 즉 qPCR에서는 증폭 과정에서 발생하는 형광 신호를 각 사이클에서 측정합니다. 따라서 반응이 진행되면서 표적 핵산이 증가하는 모습을 실시간으로 추적할 수 있다는 차이가 있습니다.

분자진단 자료에서 자주 등장하는 Ct 또는 Cq 값도 이러한 실시간 PCR과 관련된 개념입니다.

일정한 형광 기준값에 도달하는 데 필요한 PCR 사이클과 관련된 값으로, 초기 표적 핵산의 양과 관계가 있습니다. 다만 Ct 값 하나만으로 모든 검사 결과를 동일한 기준에서 단순 비교할 수 있는 것은 아닙니다.

시약, 장비, 분석 조건과 검사법 등에 영향을 받을 수 있기 때문에 구체적인 결과는 해당 검사법의 판정 기준에 따라 해석해야 합니다.

디지털 PCR은 무엇이 다를까?

디지털 PCR(digital PCR, dPCR) 역시 PCR을 기반으로 하지만 반응을 처리하고 정량하는 방식에서 중요한 차이가 있습니다.

핵심 개념은 partitioning, 즉 분할​입니다.

하나의 PCR 반응액을 그대로 분석하는 대신 다수의 작은 독립적인 반응 공간으로 나눕니다. 플랫폼에 따라 작은 웰이나 액적(droplet) 등이 이러한 반응 공간으로 이용될 수 있습니다.

Droplet digital PCR(ddPCR)의 경우에는 시료를 매우 많은 미세한 액적으로 나누어 각각을 하나의 PCR 반응 공간처럼 사용합니다. FDA 역시 droplet digital PCR 시스템을 핵산 시료를 나노리터 이하 크기의 액적으로 분할한 뒤 증폭·검출·분석하는 시스템으로 설명하고 있습니다.

PCR 반응 후 각각의 partition을 살펴보면 표적이 검출된 양성(positive)​과 검출되지 않은 음성(negative)​으로 구분할 수 있습니다.

양성과 음성만으로 핵산의 양을 어떻게 알까?

디지털 PCR에서 흥미로운 부분이 바로 정량 원리입니다.

예를 들어 시료를 수많은 작은 반응 공간으로 무작위 분배했다고 생각해 보겠습니다.

표적 DNA가 들어간 partition에서는 PCR 증폭 후 신호가 검출될 수 있고, 표적이 들어가지 않은 partition에서는 신호가 나타나지 않습니다.

그렇다고 양성 partition의 개수가 곧바로 DNA 분자의 개수가 되는 것은 아닙니다.

하나의 partition에 표적 분자가 두 개 이상 들어갈 수도 있기 때문입니다.

따라서 디지털 PCR에서는 양성·음성 partition의 비율을 이용하고 일반적으로 포아송(Poisson) 통계 모델​을 적용하여 원래 시료에 존재했던 표적 분자의 농도를 추정합니다.

이러한 분할과 통계적 분석이 디지털 PCR을 이해하는 핵심입니다.

qPCR과 디지털 PCR의 정량 방식 비교

두 기술 모두 PCR을 기반으로 하지만 정량하는 접근 방식에는 차이가 있습니다.

구분	Real-time PCR(qPCR)	Digital PCR(dPCR)
기본 원리	증폭 중 형광 신호 측정	시료를 다수의 partition으로 분할
주요 데이터	증폭곡선과 Cq/Ct 등	양성·음성 partition
정량 접근	표준곡선을 이용한 정량 등이 가능	partition 비율과 통계 모델을 이용한 정량
반응 형태	하나의 반응 용기에서 측정	다수의 독립 반응으로 분할
특징	넓은 분야에서 활용되는 확립된 기술	표적 농도의 정밀한 측정에 활용 가능

디지털 PCR의 장점 가운데 하나는 표준곡선에 의존하지 않고 표적 핵산을 정량할 수 있다는 점입니다.

하지만 이것이 디지털 PCR이 모든 상황에서 qPCR보다 우수하다는 뜻은 아닙니다. 분석 목적과 필요한 검출 성능, 시료 특성, 장비 및 비용 등을 고려하여 적절한 기술을 선택해야 합니다.

디지털 PCR은 어디에 활용될까?

디지털 PCR은 정밀한 핵산 정량이 필요한 연구와 검사 분야에서 활용되고 있습니다.

예를 들어 낮은 빈도의 유전적 변이 분석, copy number variation 분석, 특정 유전자 표적의 정량 등에 적용될 수 있습니다. Droplet 방식뿐 아니라 미세한 반응 공간을 배열한 chip 또는 array 기반 방식도 존재합니다.

실제 임상용 체외진단 분야에도 디지털 PCR 기술을 이용하는 시스템과 검사가 존재합니다. 다만 특정 dPCR 기술이 사용된다는 사실과 개별 질환을 진단할 수 있다는 의미는 구분해야 합니다.

검사의 임상적 용도와 성능은 해당 검사법과 허가된 사용 목적을 기준으로 판단해야 합니다.

PCR에서 디지털 PCR까지, 핵심은 핵산을 측정하는 방법

PCR은 특정 DNA 영역을 선택적으로 증폭한다는 비교적 단순한 원리에서 출발합니다.

변성 → 결합 → 신장 → 반복

이 기본 원리를 이해하면 Real-time PCR과 디지털 PCR이 왜 등장했는지도 이해하기 쉬워집니다.

Real-time PCR은 증폭 과정의 형광 신호를 관찰하는 방식으로 발전했고, 디지털 PCR은 시료를 수많은 작은 반응 공간으로 나눈 후 각각의 양성·음성 결과를 통계적으로 분석하는 방법으로 발전했습니다.

따라서 디지털 PCR을 단순히 ‘더 새로운 PCR’이라고 이해하기보다는 PCR 반응을 분할하고 정량하는 방법을 변화시킨 기술로 바라보는 것이 적절합니다.

이러한 차이를 이해해 두면 이후 PCR primer, probe, Ct 값, fluorescence, multiplex PCR 등의 분자진단 개념을 공부할 때도 각각의 역할을 구분하기가 한결 쉬워집니다.

※ 이 글은 PCR 및 디지털 PCR의 기술적 원리를 이해하기 위한 교육 목적의 자료이며 개인의 검사 결과 해석이나 질병의 진단·치료를 위한 의료 조언을 제공하지 않습니다.