Primer Exchange Reaction을 이용한 등온 핵산 증폭 기술의 원리

Primer Exchange Reaction(PER)은 일정한 온도에서 짧은 DNA primer를 연장하면서 미리 설계한 sequence를 반복적으로 추가할 수 있는 DNA 합성 반응입니다. 일반적인 PCR처럼 온도를 반복해서 바꾸지 않고 catalytic hairpin과 strand-displacing polymerase를 이용한다는 점이 특징입니다.

PER은 어떤 반응일까?

PCR에서는 template DNA를 복제해 target DNA의 copy number를 증가시킵니다.

RCA에서는 circular DNA template를 따라 polymerase가 이동하면서 긴 반복 sequence를 합성합니다.

PER은 이들과 다른 방식으로 작동합니다.

핵심 구성 요소는 짧은 primer, 미리 설계된 catalytic hairpin, 그리고 DNA를 합성하는 strand-displacing polymerase입니다.

Primer가 hairpin에 일시적으로 결합하면 polymerase가 hairpin 내부의 sequence information을 이용해 primer의 3′ 말단을 연장합니다.

연장된 primer는 hairpin에서 분리될 수 있습니다.

Hairpin은 다시 다른 primer와 반응할 수 있습니다.

따라서 catalytic hairpin 자체가 소모되지 않으면서 특정 DNA sequence를 primer에 반복적으로 추가할 수 있습니다.

기본 구성 요소부터 살펴보면

PER system은 설계에 따라 복잡도가 달라질 수 있지만 기본적인 개념은 다음 요소로 설명할 수 있습니다.

Primer

반응을 시작하는 짧은 DNA strand입니다.

Catalytic Hairpin

Primer를 인식하는 영역과 primer에 추가할 sequence 정보를 가지고 있습니다.

DNA Polymerase

Primer의 3′ end에서 새로운 DNA를 합성합니다.

dNTP

새로운 DNA strand를 만드는 nucleotide 재료입니다.

여기에서 중요한 것은 hairpin이 단순한 구조체가 아니라 어떤 sequence를 primer에 추가할지 결정하는 programmable template 역할을 한다는 점입니다.

Primer가 Hairpin에 먼저 결합한다

PER의 첫 단계는 primer와 catalytic hairpin 사이의 hybridization입니다.

Hairpin에는 primer의 3′ 말단과 상보적인 영역이 노출되도록 설계할 수 있습니다.

Primer가 이 영역에 결합하면 polymerase가 작동할 수 있는 primer-template junction이 만들어집니다.

이때 primer의 3′-OH는 DNA synthesis를 시작할 수 있는 위치가 됩니다.

Polymerase는 hairpin을 template로 사용해 primer를 연장합니다.

즉,

Primer Recognition

→ Hairpin Binding

→ Polymerase Extension

순서로 첫 번째 반응이 진행됩니다.

Hairpin 내부의 Sequence가 Primer로 복사된다

Primer가 catalytic hairpin에 결합하면 polymerase는 hairpin template 영역을 따라 새로운 nucleotide를 추가합니다.

Hairpin에 특정 sequence가 설계되어 있다면 그 정보가 primer의 3′ end에 복사됩니다.

예를 들어 초기 primer를

a

라고 하고 hairpin이 primer에

b

라는 sequence를 추가하도록 설계했다고 가정할 수 있습니다.

그러면 반응 후 primer는

a-b

형태로 연장됩니다.

이 과정에서 중요한 것은 원래 primer 전체를 복제하는 것이 아니라 primer 끝에 새로운 정보 domain을 추가한다는 것입니다.

Stopper가 Polymerase의 연장 범위를 제한한다

Catalytic hairpin에서 polymerase가 원하는 위치까지만 extension하도록 제어할 필요가 있습니다.

그렇지 않으면 polymerase가 hairpin 전체를 계속 복제하면서 설계하지 않은 product를 만들 수 있습니다.

PER에서는 hairpin template 내부에 polymerase extension을 제한하는 stopper를 사용할 수 있습니다.

Stopper는 polymerase가 특정 위치를 넘어 계속 합성하지 못하도록 설계된 chemical modification 또는 비정상적인 nucleotide 구조일 수 있습니다.

이를 통해 primer에 추가되는 sequence의 길이를 제어할 수 있습니다.

따라서 catalytic hairpin은

Primer Binding Region

Template Region

Polymerase Stop Region

과 같은 기능적인 요소를 포함하도록 설계할 수 있습니다.

연장된 Primer는 어떻게 Hairpin에서 빠져나올까?

Primer extension이 끝난 뒤 product가 hairpin에 계속 붙어 있다면 다음 reaction cycle이 진행되기 어렵습니다.

PER에서는 hairpin 구조와 strand displacement 특성을 이용해 extended primer가 catalytic hairpin에서 분리될 수 있도록 설계합니다.

연장 과정에서 hairpin의 구조적 변화가 발생하고 새롭게 합성된 product가 release될 수 있습니다.

Hairpin은 다시 원래와 유사한 catalytic state로 돌아갈 수 있습니다.

따라서 하나의 hairpin이 한 번만 사용되는 것이 아니라 여러 primer molecule과 반복적으로 반응할 수 있습니다.

이것이 이름에 Primer Exchange가 포함되는 이유를 이해하는 중요한 부분입니다.

Catalytic Hairpin이 소모되지 않는 것이 핵심이다

일반적인 DNA template에서도 polymerase extension은 일어날 수 있습니다.

하지만 PER에서는 hairpin을 catalytic하게 재사용할 수 있도록 구조를 설계합니다.

한 번의 reaction을 단순화하면

Primer + Hairpin

→ Primer-Hairpin Complex

→ Polymerase Extension

→ Extended Primer Release

→ Hairpin Regeneration

으로 표현할 수 있습니다.

Regenerated hairpin은 다시 새로운 primer를 받아 동일한 reaction을 반복할 수 있습니다.

따라서 적은 양의 catalytic hairpin으로 여러 primer를 변환할 수 있습니다.

PER과 PCR의 가장 큰 차이

두 기술 모두 DNA polymerase를 사용하지만 목적과 reaction architecture가 다릅니다.

PCR에서는 target DNA의 특정 영역을 반복적으로 복제합니다.

Denaturation, annealing, extension을 반복하기 위해 온도를 주기적으로 변경합니다.

PER에서는 catalytic hairpin에 저장된 sequence information을 primer에 추가합니다.

일정한 온도에서 reaction을 진행할 수 있으며 thermal cycling이 필요하지 않습니다.

즉,

PCR → Target Sequence의 Exponential Copying

PER → Programmable Primer Extension

이라는 차이가 있습니다.

따라서 PER을 단순히 ‘온도를 바꾸지 않는 PCR’이라고 설명하는 것은 적절하지 않습니다.

PER과 RCA도 다르다

RCA는 circular DNA template를 사용합니다.

Strand-displacing polymerase가 원형 template를 여러 번 회전하면서 긴 concatemeric DNA를 생성합니다.

결과적으로 circular template에 존재하는 sequence가 반복됩니다.

PER에서는 원형 template가 필수적이지 않습니다.

대신 catalytic hairpin을 이용해 primer의 끝에 원하는 sequence domain을 추가합니다.

PER에서는 여러 hairpin을 연결해 primer가 순차적으로 서로 다른 정보를 획득하도록 만들 수도 있습니다.

따라서

RCA → Circular Template의 반복 복제

PER → Hairpin-Programmed Sequence Addition

으로 구분할 수 있습니다.

LAMP와도 반응 구조가 다르다

LAMP 역시 strand-displacing polymerase를 이용하는 대표적인 isothermal amplification입니다.

그러나 LAMP는 일반적으로 여러 primer를 이용해 target sequence를 증폭하고 stem-loop structure가 반복적으로 형성되는 amplification network를 만듭니다.

PER은 target nucleic acid 전체를 빠르게 증폭하는 것이 기본 목적이 아닙니다.

Catalytic hairpin에 의해 primer에 특정 sequence를 단계적으로 추가하는 것이 핵심입니다.

따라서 같은 strand-displacing polymerase를 사용한다고 해서 두 기술의 molecular mechanism이 동일한 것은 아닙니다.

여러 Hairpin을 연결하면 Sequence를 프로그래밍할 수 있다

PER의 흥미로운 특징은 서로 다른 catalytic hairpin을 조합할 수 있다는 점입니다.

예를 들어 첫 번째 hairpin이 primer에 sequence b를 추가하도록 설계할 수 있습니다.

그러면

a → a-b

가 됩니다.

두 번째 hairpin은 새롭게 생성된 b 영역을 인식하고 sequence c를 추가하도록 설계할 수 있습니다.

그러면

a-b → a-b-c

가 됩니다.

세 번째 hairpin을 추가하면

a-b-c → a-b-c-d

처럼 reaction을 이어갈 수 있습니다.

즉, 여러 catalytic hairpin을 사용하면 DNA primer에 정보 domain을 순차적으로 추가하는 molecular program을 만들 수 있습니다.

Hairpin의 출력이 다음 Hairpin의 입력이 된다

이러한 cascade가 가능한 이유는 한 reaction에서 새롭게 추가된 sequence가 다음 reaction의 recognition domain으로 작동할 수 있기 때문입니다.

첫 번째 hairpin에서 만들어진 output sequence가 두 번째 hairpin의 input 역할을 합니다.

이를 개념적으로 표현하면

Input a

→ Hairpin 1

→ a-b

→ Hairpin 2

→ a-b-c

→ Hairpin 3

→ a-b-c-d

와 같습니다.

따라서 PER은 단순한 DNA extension reaction을 넘어 programmable molecular information processing에 이용될 수 있습니다.

동일한 Sequence를 반복적으로 추가할 수도 있다

PER system은 서로 다른 sequence를 순차적으로 추가하는 데만 사용할 필요는 없습니다.

적절한 catalytic hairpin architecture를 설계하면 특정 sequence motif가 반복적으로 추가되도록 만들 수도 있습니다.

그 결과 하나의 primer에서 긴 repetitive DNA product를 형성할 수 있습니다.

반복 sequence에 fluorescent probe가 결합하도록 설계한다면 하나의 initiation event에서 여러 reporter binding site를 생성할 수 있습니다.

이러한 구조는 PER을 biosensor의 signal amplification component로 활용할 수 있게 합니다.

Target Recognition과 PER을 어떻게 연결할까?

PER 자체가 특정 질병 biomarker를 자동으로 인식하는 것은 아닙니다.

따라서 biosensor에서는 target recognition step을 PER initiation과 연결해야 합니다.

예를 들어 target DNA 또는 RNA가 존재할 때만 PER primer가 노출되도록 molecular probe를 설계할 수 있습니다.

Target이 없으면 primer의 3′ end가 구조 내부에 가려져 polymerase extension이 일어나지 않습니다.

Target이 probe와 결합하면 구조가 열리고 active primer가 노출됩니다.

그 다음 PER이 시작됩니다.

즉,

Target Recognition

→ Primer Activation

→ PER Initiation

→ Repeated Sequence Extension

→ Signal Generation

과 같은 sensor architecture를 만들 수 있습니다.

miRNA 검출과 연결할 수 있는 이유

miRNA는 짧은 sequence를 가지고 있기 때문에 일반적인 primer pair를 사용하는 amplification design이 까다로울 수 있습니다.

PER에서는 target miRNA를 직접 길게 복제하지 않고 target recognition을 active primer 생성이나 catalytic hairpin activation으로 연결할 수 있습니다.

예를 들어 miRNA가 complementary probe와 결합했을 때 blocked primer가 release되도록 설계할 수 있습니다.

Release된 primer는 PER circuit으로 들어가 긴 DNA product를 만들 수 있습니다.

이 경우 miRNA 자체가 증폭되는 것이 아니라 miRNA recognition event가 DNA synthesis reaction으로 변환됩니다.

따라서 target amplification과 signal amplification을 구분해야 합니다.

Fluorescence Detection과 연결하는 방법

PER product는 다양한 fluorescence reporter와 연결할 수 있습니다.

가장 단순한 방법 중 하나는 newly synthesized DNA에 complementary fluorescent probe를 결합시키는 것입니다.

PER이 진행될수록 reporter-binding sequence가 증가하도록 설계하면 fluorescence도 증가할 수 있습니다.

또 다른 방법으로는 DNA-binding fluorescent dye를 이용할 수 있습니다.

긴 DNA product가 생성될수록 double-stranded region이 증가하도록 설계한다면 DNA-binding dye의 fluorescence 변화로 reaction을 확인할 수 있습니다.

다만 nonspecific DNA synthesis가 발생하면 dye 역시 signal을 만들 수 있으므로 specificity는 별도의 target-recognition architecture로 확보해야 합니다.

G-Quadruplex Reporter와 연결할 수도 있다

PER product에 G-rich sequence가 반복적으로 포함되도록 설계할 수도 있습니다.

생성된 G-rich DNA가 적절한 조건에서 G-quadruplex를 형성하고 hemin과 결합하면 peroxidase-like catalytic activity를 갖는 G4/hemin DNAzyme 구조를 만들 수 있습니다.

이 구조를 colorimetric 또는 chemiluminescent reporter와 연결할 수 있습니다.

전체적으로는

Target Recognition

→ PER Activation

→ G-Rich Sequence Extension

→ G-Quadruplex Formation

→ Hemin Binding

→ Catalytic Signal

과 같은 cascade가 가능합니다.

중요한 점은 G-quadruplex 자체를 무조건 DNAzyme이라고 부르는 것이 아니라 G4와 hemin이 결합한 catalytic complex를 구분해서 설명하는 것입니다.

PER와 Strand Displacement는 어떤 관계일까?

PER에는 strand-displacing polymerase가 사용될 수 있습니다.

여기에서 말하는 strand displacement는 앞서 살펴본 Toehold-Mediated Strand Displacement(TMSD)와 구분해야 합니다.

TMSD에서는 새로운 oligonucleotide가 toehold에 결합하고 branch migration을 통해 기존 strand를 밀어냅니다.

Polymerase-driven strand displacement에서는 polymerase가 DNA를 합성하면서 앞에 존재하는 strand를 밀어냅니다.

따라서

TMSD → Hybridization과 Branch Migration

PER의 Strand Displacement → Polymerase-Driven DNA Synthesis

라는 차이가 있습니다.

두 현상을 모두 strand displacement라고 부를 수 있지만 molecular driving force가 다릅니다.

PER이 Isothermal Reaction인 이유

PCR에서는 double-stranded DNA를 분리하기 위해 높은 온도의 denaturation 과정이 필요합니다.

PER은 이러한 thermal cycling 없이 일정한 온도에서 reaction을 진행하도록 설계할 수 있습니다.

Primer와 hairpin의 hybridization, polymerase extension, product release가 동일한 reaction environment에서 반복됩니다.

따라서 복잡한 thermal cycler 없이 nucleic acid synthesis를 수행할 수 있다는 특징이 있습니다.

그러나 isothermal이라는 사실만으로 모든 PER assay가 point-of-care에 바로 적합한 것은 아닙니다.

정확한 temperature control과 enzyme storage, sample preparation 및 signal detection은 여전히 필요할 수 있습니다.

Leak Extension은 중요한 문제다

Target-dependent PER biosensor에서 가장 주의해야 할 문제 가운데 하나는 leak reaction입니다.

Target이 없는데도 primer가 catalytic hairpin과 반응하면 background product가 생성됩니다.

PER은 downstream에서 많은 DNA sequence를 생성할 수 있기 때문에 작은 leak도 시간이 지나면서 큰 background signal로 나타날 수 있습니다.

Leak의 원인은 여러 가지가 있을 수 있습니다.

Probe의 불완전한 blocking, 예상하지 못한 hybridization, hairpin breathing 또는 unintended primer-template interaction 등이 원인이 될 수 있습니다.

따라서 target-dependent primer activation과 background suppression을 함께 최적화해야 합니다.

Secondary Structure도 Reaction Rate에 영향을 준다

PER에서 DNA sequence는 단순한 정보 문자열이 아닙니다.

각 sequence는 실제로 secondary structure를 형성할 수 있습니다.

Primer가 강한 hairpin을 자체적으로 형성하면 catalytic hairpin에 접근하기 어려울 수 있습니다.

반대로 catalytic hairpin의 stem이 지나치게 불안정하면 target이나 primer가 없어도 구조가 열릴 수 있습니다.

새롭게 합성된 product 역시 다른 probe나 hairpin과 예상하지 못한 interaction을 만들 수 있습니다.

따라서 sequence design에서는 complementarity뿐 아니라 전체 reaction network에서 발생할 수 있는 secondary structure를 고려해야 합니다.

Hairpin Concentration을 높이면 항상 빨라질까?

Catalytic hairpin concentration이 증가하면 primer가 hairpin을 만날 확률이 증가할 수 있습니다.

그러나 농도를 무조건 높이는 것이 항상 좋은 결과를 만드는 것은 아닙니다.

높은 oligonucleotide concentration에서는 unintended hybridization과 background reaction이 증가할 수 있습니다.

여러 종류의 catalytic hairpin을 사용하는 cascade에서는 cross-interaction 가능성도 커집니다.

따라서 PER optimization에서는 reaction speed만 볼 것이 아니라

Signal Gain

Background

Leak

Specificity

를 함께 비교해야 합니다.

PER의 장점은 Sequence 자체를 출력으로 만들 수 있다는 점이다

많은 biosensor는 target을 인식한 뒤 fluorescence나 color change를 바로 출력합니다.

PER에서는 중간에 새로운 DNA sequence를 output으로 생성할 수 있습니다.

이 output은 다시 다른 molecular reaction의 input으로 사용할 수 있습니다.

예를 들어 PER product가 CHA를 시작하는 initiator가 될 수도 있고 HCR hairpin을 여는 trigger가 될 수도 있습니다.

또는 CRISPR nuclease가 인식하는 target sequence를 PER product 내부에 만들 수도 있습니다.

따라서 PER은 단순한 signal generator뿐 아니라 여러 molecular circuits 사이를 연결하는 sequence transducer로 활용할 수 있습니다.

CRISPR Detection과도 결합할 수 있다

PER product에 특정 CRISPR target sequence를 포함하도록 설계한다면 downstream CRISPR reaction과 연결할 수 있습니다.

Target biomarker가 존재할 때만 PER이 활성화되고 CRISPR가 인식할 수 있는 DNA product가 만들어지도록 하는 방식입니다.

이후 Cas12 같은 nuclease가 해당 product를 인식하면 collateral reporter cleavage를 유도할 수 있습니다.

전체 구조는

Biomarker Recognition

→ PER Activation

→ CRISPR Target Sequence 생성

→ Cas Activation

→ Reporter Cleavage

→ Signal Amplification

으로 구성할 수 있습니다.

이처럼 서로 다른 amplification mechanism을 cascade로 연결하면 sensitivity를 높일 가능성이 있지만 background 역시 함께 증폭될 수 있으므로 주의해야 합니다.

PER 기반 Biosensor의 기본 과정을 정리하면

Target-responsive PER system을 단순화하면 다음과 같습니다.

Target이 없는 경우

Blocked 또는 Inactive Primer

→ Catalytic Hairpin 접근 제한

→ Polymerase Extension 제한

→ Product 생성 최소화

→ Low Signal

Target이 존재하는 경우

Target Recognition

→ Active Primer 생성 또는 노출

→ Catalytic Hairpin Binding

→ Polymerase Extension

→ Programmed Sequence Addition

→ Extended Primer Release

→ 다음 Hairpin 또는 Reporter Reaction

→ Signal Generation

여러 catalytic hairpin을 사용하면 이 과정을 연속적으로 연결할 수 있습니다.

PER의 한계는 무엇일까?

PER은 sequence-programmable DNA synthesis라는 독특한 장점이 있지만 실제 biosensor를 설계할 때 해결해야 할 문제도 있습니다.

먼저 reaction이 DNA polymerase에 의존하기 때문에 enzyme activity와 buffer condition의 영향을 받습니다.

Target-independent primer extension이 발생하면 background가 증가할 수 있습니다.

복잡한 cascade를 만들수록 hairpin 사이의 unintended interaction도 증가할 수 있습니다.

Biological sample에서는 protein, salt, nuclease와 다른 nucleic acid가 reaction에 영향을 줄 가능성도 있습니다.

따라서 synthetic oligonucleotide를 이용한 proof-of-concept에서 좋은 성능을 보였다고 해서 실제 clinical sample에서도 동일한 결과가 보장되는 것은 아닙니다.

기존 핵산 증폭법과 PER의 차이

PER을 다른 기술과 함께 정리하면 특징이 더욱 분명해집니다.

기술	핵심 Template	주요 반응	대표적 특징
PCR	Target DNA	Thermal cycling polymerization	Target copy 증폭
LAMP	Target DNA	Loop-mediated polymerization	등온 target 증폭
RPA	Target DNA	Recombinase-mediated invasion	비교적 낮은 온도의 등온 증폭
RCA	Circular DNA	Continuous strand displacement synthesis	긴 반복 DNA 생성
PER	Catalytic hairpin	Programmed primer extension	원하는 sequence domain 추가

PER의 핵심은 target DNA 전체를 복제하는 데 있지 않습니다.

Catalytic hairpin에 저장된 sequence 정보를 primer에 원하는 순서로 전달하는 것이 가장 중요한 차이입니다.

분자진단에서 PER이 갖는 의미

분자진단에서 biomarker를 검출하려면 target recognition과 signal generation 사이를 연결해야 합니다.

PER은 이 두 단계 사이에 programmable DNA synthesis를 배치할 수 있게 합니다.

Target이 존재했을 때 active primer가 만들어지도록 설계하면 매우 짧은 recognition event를 긴 DNA product로 변환할 수 있습니다.

더 중요한 점은 생성되는 product의 sequence를 미리 설계할 수 있다는 것입니다.

따라서 단순히 signal의 양만 늘리는 것이 아니라 다음 reaction에서 사용할 분자적 명령어를 합성할 수 있습니다.

이러한 특징은 PER을 molecular computing, DNA nanotechnology와 biosensing을 연결하는 기술로 연구할 수 있게 합니다.

마치며

Primer Exchange Reaction은 catalytic hairpin과 strand-displacing DNA polymerase를 이용해 primer의 3′ 말단에 원하는 DNA sequence를 추가하는 등온 nucleic acid reaction입니다.

기본 과정은

Primer-Hairpin Recognition

→ Polymerase Extension

→ Programmed Sequence Addition

→ Extended Primer Release

→ Catalytic Hairpin 재사용

으로 정리할 수 있습니다.

여러 종류의 hairpin을 연결하면 한 단계에서 생성된 sequence가 다음 단계의 input이 되면서 더 복잡한 DNA product를 만들 수 있습니다.

이 점에서 PER은 PCR처럼 target sequence를 그대로 대량 복제하는 기술과 구별됩니다.

또한 target recognition을 primer activation과 연결하면 miRNA나 DNA biomarker를 검출하는 biosensor를 구성할 수 있고, 생성된 PER product를 fluorescence reporter, G4/hemin system, CHA·HCR 또는 CRISPR detection으로 전달할 수도 있습니다.

결국 PER의 가장 독특한 특징은 단순히 DNA 양을 늘리는 것이 아니라 catalytic hairpin에 미리 기록한 sequence 정보를 이용해 새로운 DNA output을 프로그래밍할 수 있다는 점입니다.

이 때문에 PER은 등온 핵산 반응을 넘어 programmable biosensor와 molecular circuit을 설계하는 하나의 기반 기술로 연구되고 있습니다.

※ 본 글은 Primer Exchange Reaction의 작동 원리와 핵산 바이오센서 응용을 설명하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다. 연구 단계의 분석 성능을 확립된 임상 진단검사의 성능으로 해석해서는 안 됩니다.