Padlock Probe와 Rolling Circle Amplification을 이용한 유전자 변이 검출 원리

Padlock probe는 표적 핵산을 인식하면 양쪽 말단이 서로 가까워지도록 설계된 선형 DNA probe입니다. 정확한 hybridization 이후 ligation으로 원형 DNA가 만들어지면 이를 template로 RCA를 진행해 작은 서열 차이를 큰 검출 신호로 변환할 수 있습니다.

선형 Probe를 원형 DNA로 바꾸는 검출 전략

특정 DNA sequence를 검출하는 가장 기본적인 방법은 target과 상보적인 probe를 사용하는 것입니다.

하지만 probe와 target이 결합했다는 사실만으로는 극소량의 핵산을 민감하게 검출하기 어려울 수 있습니다.

특히 single nucleotide variation처럼 정상 sequence와 변이 sequence의 차이가 한 염기에 불과한 경우에는 단순한 hybridization보다 높은 sequence discrimination이 필요합니다.

Padlock probe는 이러한 문제를 독특한 방식으로 해결합니다.

처음에는 하나의 single-stranded linear oligonucleotide이지만 원하는 target을 만나면 양쪽 끝이 target의 인접한 영역에 결합합니다.

이 상태에서 두 말단이 정확하게 연결될 수 있으면 DNA ligase가 이를 결합합니다.

결과적으로 선형이던 padlock probe가 circular DNA molecule로 변환됩니다.

이 원형화 여부를 다음 단계의 Rolling Circle Amplification과 연결하는 것이 핵심입니다.

Padlock Probe의 양쪽 끝이 Target을 인식한다

Padlock probe의 기본 구조를 단순화하면 세 부분으로 나눌 수 있습니다.

5′ Target-Recognition Arm

중앙 Backbone Sequence

3′ Target-Recognition Arm

양쪽 recognition arm은 target DNA의 서로 인접한 sequence와 상보적으로 설계합니다.

Target이 존재하지 않을 때 padlock probe는 기본적으로 선형 상태입니다.

반면 올바른 target이 존재하면 probe의 5′과 3′ 말단이 각각 target의 인접 영역에 hybridization합니다.

그러면 원래 멀리 떨어져 있던 probe의 두 말단이 target 위에서 바로 이웃하는 위치에 놓이게 됩니다.

Target DNA가 일종의 assembly template 역할을 하는 셈입니다.

Hybridization만으로는 원형 DNA가 완성되지 않는다

Padlock probe가 target에 결합했다고 바로 circular DNA가 되는 것은 아닙니다.

두 말단 사이에는 여전히 끊어진 부분, 즉 nick이 존재합니다.

이 부분을 연결하기 위해 DNA ligase가 필요합니다.

적절한 말단 화학구조와 정확한 base pairing 조건이 충족되면 ligase가 probe의 5′과 3′ 말단을 공유결합으로 연결할 수 있습니다.

그 결과 하나의 연속적인 circular oligonucleotide가 만들어집니다.

즉,

Linear Padlock Probe

→ Target Hybridization

→ Probe 양쪽 말단의 인접

→ Ligation

→ Circularized Padlock Probe

순서로 진행됩니다.

여기에서 중요한 것은 원형화 자체가 target recognition의 결과라는 점입니다.

왜 Padlock이라는 이름이 붙었을까?

Padlock probe라는 이름은 구조적인 특징에서 이해할 수 있습니다.

선형 probe의 양쪽 끝이 target의 인접 영역에 결합한 뒤 ligation되면 target 주변을 둘러싸는 원형 구조가 만들어집니다.

마치 자물쇠가 표적에 잠기는 것과 비슷한 형태입니다.

이렇게 형성된 원형 probe는 단순히 target에 결합했다가 쉽게 떨어지는 linear probe와 다른 구조적 특성을 갖습니다.

더 중요한 것은 이 원형 DNA가 이후 RCA를 위한 template가 될 수 있다는 점입니다.

따라서 padlock probe에서는 target recognition과 amplification template 생성이 서로 연결됩니다.

Ligation이 두 번째 Sequence Checkpoint가 된다

Padlock probe의 specificity를 이해하려면 hybridization과 ligation을 구분해야 합니다.

Probe의 양쪽 arm이 target에 어느 정도 결합한다고 해서 항상 효율적으로 ligation되는 것은 아닙니다.

특히 ligation junction 부근에 mismatch가 존재하면 사용하는 ligase와 assay 조건에 따라 ligation efficiency가 크게 달라질 수 있습니다.

이를 이용하면 특정 nucleotide를 구별하도록 padlock probe를 설계할 수 있습니다.

예를 들어 mutant sequence에서만 probe의 두 말단이 정확하게 맞도록 설계했다고 가정하겠습니다.

Mutant Target

Perfect Hybridization

→ 정확한 Ligation Junction 형성

→ Circular Probe 생성

Wild-Type Target

Junction 부근 Mismatch

→ Ligation Efficiency 감소

→ Circular Probe 생성 억제

이러한 차이를 후속 RCA와 연결하면 작은 sequence difference를 큰 signal difference로 확대할 수 있습니다.

다만 single-base discrimination 성능은 ligase 종류, mismatch 위치와 종류, 온도 및 probe 설계에 따라 달라지므로 모든 mismatch가 동일하게 구별되는 것은 아닙니다.

원형화된 Probe가 RCA Template가 된다

Padlock probe가 ligation을 통해 원형 DNA로 만들어지면 다음 단계인 Rolling Circle Amplification(RCA)을 진행할 수 있습니다.

RCA는 circular nucleic acid template를 이용하는 isothermal amplification 방식입니다.

Primer가 circular template에 결합하면 strand-displacing DNA polymerase가 primer를 연장합니다.

원형 template에는 물리적인 끝이 없습니다.

따라서 polymerase가 template를 한 바퀴 복제한 뒤에도 합성을 계속할 수 있습니다.

두 바퀴, 세 바퀴를 지나 계속 DNA synthesis가 진행되면서 원형 template sequence가 반복적으로 연결된 긴 single-stranded DNA product가 만들어집니다.

Padlock probe의 원형화가 중요한 이유가 여기에 있습니다.

Target이 존재하고 정확한 ligation이 일어나야 RCA에 적합한 circular template가 생성되도록 설계할 수 있기 때문입니다.

하나의 Recognition Event를 긴 DNA로 변환한다

처음에는 target에 결합한 padlock probe 하나에서 시작합니다.

Ligation이 성공하면 하나의 circular template가 만들어집니다.

RCA가 시작되면 이 작은 원형 template를 polymerase가 반복해서 복제합니다.

그 결과 하나의 target recognition event가 매우 긴 DNA product로 변환됩니다.

RCA product에는 padlock probe 내부 sequence에 대응하는 반복 영역이 다수 포함될 수 있습니다.

따라서 하나의 circular template로부터 여러 개의 signal probe가 결합할 수 있는 recognition site를 확보할 수 있습니다.

전체 개념은

Target Recognition

→ Padlock Probe Circularization

→ RCA

→ Repeated Sequence 생성

→ Signal Probe 다중 결합

으로 정리할 수 있습니다.

RCA Product는 어떻게 검출할까?

RCA가 진행됐다는 사실을 확인하는 방법은 하나로 정해져 있지 않습니다.

가장 직관적인 방법 가운데 하나는 RCA product에 상보적인 fluorescent probe를 사용하는 것입니다.

RCA product에는 동일하거나 관련된 sequence가 반복적으로 생성됩니다.

따라서 해당 sequence를 인식하는 fluorescent probe를 넣으면 하나의 긴 RCA product에 여러 probe가 결합할 수 있습니다.

결과적으로 작은 수의 circular template에서 시작했더라도 충분한 fluorescence signal을 만들 수 있습니다.

연구 목적에 따라 intercalating dye, labeled detection probe, molecular beacon, nanoparticle 또는 다른 biosensing element와 결합하는 방식도 설계할 수 있습니다.

즉, RCA는 signal 자체라기보다 후속 검출에 사용할 수 있는 많은 nucleic acid recognition site를 생성하는 amplification 단계라고 보는 것이 좋습니다.

Padlock Probe의 중앙 Sequence도 활용할 수 있다

Padlock probe에서 target recognition arm 사이에 존재하는 중앙 영역은 단순히 두 arm을 연결하기 위한 spacer로만 사용할 필요가 없습니다.

Target과 직접 상보적이지 않은 별도의 sequence를 넣어 후속 검출에 활용할 수도 있습니다.

예를 들어 중앙 영역에 detection probe가 인식할 수 있는 sequence를 설계할 수 있습니다.

Padlock probe가 circularization되고 RCA가 진행되면 이 sequence도 반복적으로 복제됩니다.

그러면 실제 target DNA 자체에는 존재하지 않는 인공적인 reporter sequence를 다수 생성할 수 있습니다.

이러한 설계는 target recognition 영역과 signal generation 영역을 분리할 수 있다는 장점이 있습니다.

즉,

Recognition Arms → Target 선택

Backbone Sequence → Signal 설계

처럼 각각 다른 역할을 부여할 수 있습니다.

Single Nucleotide Variant 검출에 활용할 수 있는 이유

Padlock probe가 유전자 변이 분석에서 관심을 받는 이유는 ligation step에 있습니다.

단 하나의 nucleotide difference를 hybridization만으로 구별하는 것은 assay condition에 따라 어려울 수 있습니다.

Padlock probe에서는 변이 위치를 ligation junction 부근에 배치하는 전략을 사용할 수 있습니다.

정확한 target에서는 probe 양쪽 끝이 적절하게 pairing되어 ligation될 수 있습니다.

반면 mismatch target에서는 ligation이 상대적으로 불리해질 수 있습니다.

이 차이가 단순한 ligation yield 차이로 끝나는 것이 아니라 다음 RCA 단계에서 크게 확대됩니다.

Perfect-Match Target

Ligation

→ Circular Template

→ RCA

→ Large Signal

Mismatch Target

Ligation 억제

→ Circular Template 감소

→ RCA 감소

→ Low Signal

즉, 작은 sequence 차이를 증폭 가능 / 증폭 억제라는 더 큰 차이로 변환할 수 있습니다.

Target 자체를 많이 증폭하는 PCR과는 다르다

Padlock probe-RCA와 PCR의 amplification 개념에는 차이가 있습니다.

PCR에서는 target 영역 자체를 primer 사이에서 반복적으로 복제해 target-derived amplicon 수를 증가시킵니다.

Padlock probe assay에서는 먼저 target을 이용해 probe를 circularization합니다.

이후 amplification되는 핵심 template는 원래 target DNA 전체가 아니라 target recognition에 성공한 padlock probe에서 만들어진 circular DNA입니다.

따라서

Target → 직접 대량 증폭

이라기보다

Target → Circular Probe 생성 → Circular Probe 증폭

이라는 구조입니다.

이러한 차이 때문에 recognition과 amplification을 기능적으로 분리해 assay를 설계할 수 있습니다.

Linear Probe가 남아 있으면 문제가 되지 않을까?

실제 assay에서는 모든 padlock probe가 circularization되는 것은 아닙니다.

Target과 만나지 못한 probe나 ligation에 실패한 linear probe가 남을 수 있습니다.

이러한 linear DNA가 비특이적인 background reaction에 관여하면 assay 성능에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 일부 padlock probe assay에서는 circularized product와 남아 있는 linear oligonucleotide를 구분하기 위한 추가적인 처리 전략을 사용합니다.

예를 들어 특정 exonuclease는 linear DNA를 분해하면서 closed circular DNA는 상대적으로 보존하는 방식으로 활용될 수 있습니다.

그러면

Ligation 실패 Linear Probe → 제거

Circularized Padlock Probe → 유지

가 가능해져 후속 RCA의 background를 낮추는 데 도움이 될 수 있습니다.

다만 어떤 nuclease를 사용할지는 probe의 구조와 말단 상태, 실험 설계에 따라 달라집니다.

RCA에는 Strand-Displacing Polymerase가 필요하다

RCA에서 중요한 역할을 하는 것은 strand-displacing DNA polymerase입니다.

Polymerase가 circular template를 따라 DNA를 합성하다 보면 이전 회전에서 이미 만들어진 DNA strand와 만나게 됩니다.

이때 기존 strand를 밀어내면서 새로운 DNA synthesis를 계속할 수 있어야 긴 RCA product가 만들어집니다.

RCA 연구에서 자주 이용되는 polymerase 가운데 하나가 Phi29 DNA polymerase입니다.

Phi29 DNA polymerase는 높은 processivity와 strand displacement activity를 가지고 있어 RCA에 널리 활용됩니다.

다만 RCA가 Phi29에만 한정되는 것은 아니며 assay 목적과 반응 조건에 따라 다른 strand-displacing polymerase를 이용할 수도 있습니다.

중요한 것은 단순히 polymerase가 DNA를 합성한다는 사실보다 원형 template를 반복해서 복제하면서 기존 strand를 밀어낼 수 있는 효소 특성입니다.

등온 조건에서 증폭할 수 있다는 특징

RCA는 PCR과 달리 반복적인 thermal cycling을 필요로 하지 않습니다.

적절한 온도를 유지하면서 polymerase reaction을 지속할 수 있습니다.

따라서 heater와 cooler를 빠르게 반복 제어해야 하는 thermal cycler 없이도 amplification system을 구성할 수 있습니다.

이러한 특징 때문에 RCA는 microfluidic device, paper-based assay, fluorescence biosensor 및 다양한 point-of-care 연구와 결합되어 왔습니다.

하지만 ‘등온 반응이므로 무조건 현장진단에 적합하다’고 단정해서는 안 됩니다.

실제 현장형 장치에서는 sample preparation, reagent stability, contamination control, signal reader, reaction time 등도 함께 해결해야 하기 때문입니다.

Padlock Probe는 RNA 검출에도 응용할 수 있다

Padlock probe의 target은 반드시 genomic DNA에 한정되지 않습니다.

설계와 전처리 방법에 따라 RNA 분석에도 응용할 수 있습니다.

RNA sequence를 직접 recognition 과정에 이용하거나 reverse transcription을 통해 만들어진 cDNA를 target으로 사용하는 방식 등이 가능합니다.

특히 짧은 RNA나 특정 transcript를 구별하는 assay에서는 padlock probe의 sequence specificity와 RCA의 signal amplification을 결합하는 연구가 가능합니다.

다만 DNA ligase마다 RNA-DNA hybrid 또는 특정 nick structure에 대한 substrate preference가 다르기 때문에 ‘DNA용 padlock probe를 그대로 RNA에 사용하면 된다’고 볼 수는 없습니다.

Target 종류에 맞는 ligation chemistry를 선택해야 합니다.

In Situ 분석에서도 Padlock Probe가 사용되는 이유

Padlock probe와 RCA의 또 다른 특징은 amplification product가 최초 recognition 위치 주변에 국소적으로 형성되도록 설계할 수 있다는 점입니다.

세포나 조직에 존재하는 target을 padlock probe가 인식하고 그 자리에서 circularization과 RCA가 진행되면 긴 RCA product가 비교적 좁은 공간에 모일 수 있습니다.

이후 fluorescent detection probe를 결합하면 하나의 recognition event가 밝은 fluorescent spot으로 나타날 수 있습니다.

따라서 단순히 target의 양을 측정하는 것뿐 아니라 어느 세포 또는 어느 위치에서 특정 sequence가 검출됐는지 확인하는 spatial analysis에도 응용할 수 있습니다.

이것은 용액 전체에서 fluorescence intensity만 측정하는 일반적인 bulk assay와 다른 활용 방향입니다.

Multiplex 분석은 어떻게 가능할까?

여러 종류의 padlock probe를 서로 다른 target에 맞춰 설계할 수도 있습니다.

각 probe의 target-recognition arm은 서로 다른 sequence를 인식하도록 만들고 중앙 backbone에는 target별로 구분되는 barcode sequence를 넣을 수 있습니다.

RCA가 진행되면 각 padlock probe에서 서로 다른 barcode sequence가 반복적으로 생성됩니다.

이후 barcode별 fluorescent detection probe를 사용하면 여러 target을 구분하는 방식의 multiplex assay를 설계할 수 있습니다.

즉, target sequence 자체를 모두 서로 다른 fluorescence probe로 직접 구별하기보다 padlock probe 내부에 설계한 barcode를 통해 signal identity를 부여할 수 있습니다.

이는 padlock probe가 단순한 hybridization probe를 넘어 programmable detection platform으로 활용될 수 있는 이유 가운데 하나입니다.

Padlock Probe 설계에서 중요한 부분

Padlock probe의 성능은 단순히 target과 상보적인 양쪽 arm을 만드는 것만으로 결정되지 않습니다.

먼저 두 recognition arm이 target의 인접한 영역에 정확하게 hybridization해야 합니다.

특히 mutation discrimination이 목적이라면 분석하려는 nucleotide와 ligation junction의 위치 관계가 중요합니다.

Probe가 지나치게 강하게 결합하면 mismatch가 존재해도 충분히 hybridization할 수 있고, 반대로 너무 불안정하면 perfect-match target에서도 ligation efficiency가 낮아질 수 있습니다.

또한 ligase가 요구하는 substrate structure와 reaction temperature도 고려해야 합니다.

이후 RCA에 필요한 primer-binding region과 detection sequence도 함께 설계해야 합니다.

따라서 하나의 padlock probe 안에는

Target Recognition

Ligation

Amplification

Signal Detection

에 필요한 설계 요소가 동시에 들어갈 수 있습니다.

Padlock Probe-RCA의 한계도 있다

Padlock probe와 RCA는 높은 specificity와 signal amplification을 결합할 수 있지만 모든 분석 문제를 자동으로 해결하는 것은 아닙니다.

첫 번째로 ligation efficiency가 충분하지 않으면 실제 target이 존재해도 circular template 생성량이 감소할 수 있습니다.

두 번째로 target-independent circularization이나 nonspecific amplification이 발생하면 background가 증가할 수 있습니다.

세 번째로 매우 복잡한 biological sample에서는 target 접근성이나 DNA 구조, sample preparation 등이 hybridization과 ligation에 영향을 줄 수 있습니다.

또한 RCA는 긴 DNA product를 생성하지만 assay 구성에 따라 reaction time이 길어질 수 있습니다.

따라서 실제 분석에서는 sensitivity뿐 아니라 reaction time, background, reproducibility와 sample preparation을 함께 평가해야 합니다.

Padlock Probe와 RCA의 역할을 구분해야 한다

이 기술을 이해할 때 가장 중요한 것은 두 요소의 역할을 혼동하지 않는 것입니다.

Padlock Probe

는 target sequence를 인식하고 적절한 ligation이 일어났을 때 circular template를 만드는 역할을 합니다.

반면

Rolling Circle Amplification

은 만들어진 circular template를 반복적으로 복제해 signal을 증폭하는 역할을 합니다.

즉,

Padlock Probe = Recognition + Circularization

RCA = Amplification

입니다.

두 기술을 연결하면 target recognition 결과를 amplification 여부로 변환할 수 있습니다.

전체 검출 원리를 정리하면

Padlock probe와 RCA를 이용한 핵산 검출 과정을 단계별로 정리하면 다음과 같습니다.

Target DNA

→ Padlock Probe의 두 Recognition Arm 결합

→ 5′·3′ 말단이 Target 위에서 인접

→ DNA Ligase 작용

→ Circular Padlock Probe 생성

→ RCA Primer 결합

→ Strand-Displacing Polymerase 작용

→ Rolling Circle Amplification

→ 반복 Sequence를 가진 긴 ssDNA 생성

→ Detection Probe 결합

→ Signal 발생

변이 검출에서는 그 앞부분의 ligation specificity가 특히 중요합니다.

Perfect-Match Sequence

정확한 Hybridization

→ 효율적인 Ligation

→ Circularization

→ RCA

→ 높은 Signal

Mismatch Sequence

Ligation Junction 불일치

→ Ligation 감소

→ Circular Template 감소

→ RCA 감소

→ 낮은 Signal

결국 한 염기의 차이가 최종 단계에서는 큰 signal 차이로 확대될 수 있습니다.

마치며

Padlock probe는 target DNA에 결합하는 것에서 끝나는 일반적인 linear probe와 다른 검출 전략을 사용합니다.

Probe의 양쪽 말단이 target의 인접한 sequence를 인식하면 두 끝이 가까워지고, 적절한 조건에서 DNA ligase가 이를 연결해 circular DNA를 만듭니다.

이 circularized probe는 다시 Rolling Circle Amplification의 template로 사용됩니다.

Strand-displacing polymerase가 원형 template를 반복적으로 복제하면서 동일한 sequence가 여러 번 포함된 긴 DNA product를 생성합니다.

따라서 전체 기술의 핵심은

Sequence Recognition

→ Ligation

→ Circularization

→ Rolling Circle Amplification

→ Signal Generation

이라는 연결에 있습니다.

특히 변이 위치를 ligation junction과 연계하면 perfect-match와 mismatch 사이의 ligation 차이를 이용할 수 있습니다.

그리고 작은 ligation efficiency 차이를 RCA가 큰 signal difference로 변환할 수 있습니다.

Padlock probe-RCA 시스템은 결국 표적을 직접 대량 증폭하는 대신 정확하게 인식된 표적에서만 증폭 가능한 원형 template를 생성한다는 점에서 독특한 핵산 검출 전략이라고 할 수 있습니다.

※ 본 글은 padlock probe와 rolling circle amplification의 분자진단 원리를 설명하기 위한 교육 목적의 콘텐츠이며 특정 질환에 대한 임상 진단 성능을 의미하지 않습니다.