Centrifugal Lab-on-a-Disc와 RT-LAMP를 결합한 SARS-CoV-2 자동 분자진단 기술

Lab-on-a-disc는 원심력을 이용해 시료 전처리부터 핵산 증폭과 검출까지 하나의 디스크에서 수행하는 기술입니다. 이번 연구에서는 RNA 정제와 multiplex RT-LAMP를 통합해 SARS-CoV-2를 자동 검출했습니다.

실험실의 분자진단 과정을 하나의 Disc에 넣다

분자진단을 위해서는 단순히 핵산을 증폭하는 것만으로 충분하지 않습니다.

실제 시료를 분석하려면 sample preparation부터 시작해 핵산 추출과 정제, reagent mixing, amplification, 최종 signal detection까지 여러 과정이 필요합니다.

일반적인 실험실에서는 이러한 작업을 여러 장비와 pipette을 이용해 단계별로 수행합니다.

Lab-on-a-disc는 이러한 분석 과정을 작은 centrifugal disc 안에 통합하는 microfluidic technology입니다.

Disc를 일정한 속도로 회전시키면 발생하는 centrifugal force를 이용해 액체를 chamber 사이로 이동시킬 수 있습니다.

회전속도와 microchannel, valve 등의 구조를 적절하게 설계하면 용액의 이동뿐 아니라 분주, 세척, 혼합 등의 과정도 순차적으로 수행할 수 있습니다.

이번 논문의 연구진은 이러한 원리를 이용해 SARS-CoV-2 RNA purification부터 RT-LAMP와 fluorescence detection까지 통합한 centrifugal genetic analyzer를 개발했습니다.

SARS-CoV-2 진단에 자동화가 필요한 이유

논문의 연구 배경은 COVID-19 진단에서 시작됩니다.

SARS-CoV-2와 같은 감염성 바이러스를 관리하려면 감염 여부를 빠르고 정확하게 확인할 수 있는 진단 기술이 중요합니다.

COVID-19 유행 당시에는 항체를 측정하는 serological assay와 viral RNA를 직접 검출하는 molecular diagnostic method 등이 활용됐습니다.

혈청학적 검사는 항체 형성 시점 등의 영향을 받을 수 있기 때문에 바이러스 감염 초기의 직접적인 RNA 검출과는 목적과 진단 시점이 다릅니다.

반면 RT-PCR은 viral RNA를 reverse transcription한 뒤 특정 유전자 영역을 증폭해 검출할 수 있어 SARS-CoV-2 분자진단의 핵심적인 방법으로 활용됐습니다.

하지만 RT-PCR을 수행하려면 thermal cycling과 fluorescence detection이 가능한 장비가 필요합니다.

시료에서 RNA를 정제하는 전처리 과정도 별도로 수행해야 합니다.

연구진은 이러한 여러 작업을 통합해 point-of-care testing에 활용할 수 있는 자동화된 genetic analyzer를 개발하는 데 주목했습니다.

Centrifugal Microfluidics를 선택한 이유

Microfluidic technology는 작은 channel과 chamber 안에서 극소량의 액체를 제어할 수 있는 기술입니다.

그중 centrifugal microfluidics에서는 disc 자체의 회전을 이용해 액체를 이동시킵니다.

일반적인 microfluidic system에서는 액체를 이동시키기 위해 외부 pump나 복잡한 pressure controller가 필요할 수 있습니다.

Centrifugal platform에서는 disc를 회전시키는 motor를 이용해 액체에 centrifugal force를 가할 수 있습니다.

이를 통해 시료를 바깥쪽 chamber로 이동시키거나 정해진 위치로 분배할 수 있습니다.

이번 연구에서는 이러한 특징을 이용해 RNA purification 과정에서 필요한 sample loading, washing, elution과 이후 RT-LAMP reaction chamber로의 분주를 연결했습니다.

즉, disc가 단순한 reaction container가 아니라 여러 분자진단 단계를 연결하는 자동화된 fluidic platform 역할을 합니다.

10개 시료를 한 번에 분석하도록 설계하다

이번 시스템에서 눈에 띄는 특징은 하나의 disc에서 한 개의 시료만 분석하도록 설계하지 않았다는 점입니다.

연구진은 centrifugal disc에 10개의 integrated functional unit을 구성했습니다.

따라서 한 번의 분석에서 10개의 sample을 병렬로 처리할 수 있습니다.

각 sample은 RNA purification 과정을 거친 뒤 다시 세 개의 reaction chamber로 나뉩니다.

이 세 reaction chamber에는 각각 SARS-CoV-2의

orf1ab

N gene

S gene

을 검출하기 위한 RT-LAMP primer가 배치됐습니다.

따라서 하나의 sample에 대해 세 가지 viral target을 동시에 확인할 수 있도록 설계한 것입니다.

이러한 구조 때문에 연구진은 이를 단순한 RT-LAMP device가 아니라 자동화와 multiplex detection, parallel sample processing을 결합한 genetic analyzer로 구성했습니다.

Sample-to-Answer 시스템이 중요한 이유

현장형 분자진단에서 중요한 개념 가운데 하나가 sample-to-answer입니다.

사용자가 sample을 넣은 뒤 여러 번 tube를 옮기거나 reagent를 pipetting하지 않아도 전처리부터 최종 결과까지 장치 내부에서 연속적으로 처리되는 형태를 의미합니다.

핵산 기반 진단에서는 특히 sample preparation이 중요합니다.

검체에는 target nucleic acid뿐 아니라 protein과 여러 biological component가 존재할 수 있으며 이후 amplification reaction을 방해하는 물질도 포함될 수 있습니다.

따라서 단순히 LAMP reaction chamber만 작게 만드는 것으로 완전한 현장형 molecular diagnostic system이 되는 것은 아닙니다.

Sample Preparation

→ Nucleic Acid Purification

→ Amplification

→ Signal Detection

을 하나의 장치 안에서 연결하는 것이 중요합니다.

이번 lab-on-a-disc system 역시 이 통합 과정에 초점을 맞췄습니다.

첫 단계는 Sample Preparation이다

논문의 schematic을 따라 실제 분석 과정을 살펴보겠습니다.

Step 1에서는 SARS-CoV-2 sample과 관련 buffer 및 carrier RNA를 혼합한 뒤 약 10분 동안 room temperature에서 incubation합니다.

이렇게 준비된 lysate sample을 disc의 sample chamber에 loading합니다.

이후부터는 centrifugal protocol에 따라 disc가 회전하면서 액체가 정해진 chamber와 channel을 따라 이동합니다.

연구진이 제안한 장치에서는 이러한 fluidic operation이 자동으로 연결되도록 설계했습니다.

따라서 이후의 RNA purification과 분주를 사람이 반복적으로 pipetting하는 방식과 차이가 있습니다.

GF/F Filter에서 RNA를 포획한다

Step 2에서는 sample chamber에 있던 lysate가 회전에 의해 GF/F extraction column으로 이동합니다.

GF/F는 glass microfiber filter를 이용하는 extraction component입니다.

Sample이 filter column을 통과하면서 RNA가 filter에 포획되고 나머지 solution은 waste chamber로 이동합니다.

이 단계에서 중요한 것은 disc의 회전이 단순히 sample을 섞는 데 사용되는 것이 아니라는 점입니다.

Centrifugal force가 sample을 정해진 방향으로 이동시키면서 nucleic acid extraction 과정까지 수행하도록 설계됐습니다.

결과적으로 target viral RNA는 filter에 남고 불필요한 sample components는 이후 washing을 통해 제거할 수 있는 상태가 됩니다.

Washing으로 증폭 방해물질을 제거한다

RNA가 GF/F filter에 포획된 다음에는 washing 과정이 진행됩니다.

Step 3과 Step 4에서는 washing solution이 filter를 통과합니다.

RNA는 filter에 유지하면서 이후 RT-LAMP에 방해가 될 수 있는 잔여물질을 제거합니다.

사용된 washing solution과 제거된 성분은 waste chamber로 이동합니다.

연구진은 한 번의 washing으로 끝내지 않고 Step 5와 Step 6에서 추가적인 washing을 수행합니다.

따라서 이 부분은

RNA Capture

→ First Washing

→ Second Washing

으로 이어지는 purification 과정이라고 볼 수 있습니다.

Lab-on-a-disc 안에서도 일반적인 nucleic acid purification에서 수행하는 capture와 washing 원리가 그대로 구현된 것입니다.

Elution으로 정제된 RNA를 회수한다

Washing이 끝나면 filter에 포획되어 있는 RNA를 다시 회수해야 합니다.

이를 위해 Step 7에서는 elution solution을 사용합니다.

Elution solution이 GF/F column을 통과하면서 filter에 포획되어 있던 RNA를 분리합니다.

이후 disc를 회전시키면 eluted RNA solution이 Step 8에서 collection chamber로 이동합니다.

여기까지 진행되면 amplification에 사용할 수 있는 purified RNA solution을 확보하게 됩니다.

즉,

Sample Loading

→ GF/F Filter Capture

→ Washing

→ Elution

→ RNA Collection

과정이 하나의 centrifugal disc 내부에서 연결됩니다.

정제한 RNA를 세 개의 Reaction Chamber로 나눈다

다음으로 중요한 과정은 purified RNA의 분주입니다.

Collection chamber로 이동한 RNA solution은 이후 aliquoting 과정을 거칩니다.

논문의 system에서는 각 sample의 purified RNA를 세 개의 RT-LAMP reaction chamber로 분배합니다.

각 chamber는 서로 다른 SARS-CoV-2 target gene을 검출하도록 구성됩니다.

연구진은 각각

orf1ab

N

S

유전자를 target으로 설정했습니다.

각 reaction chamber에는 해당 유전자를 증폭하기 위한 RT-LAMP primer가 미리 배치되어 있습니다.

따라서 정제된 RNA가 reaction chamber에 들어가면 각각의 target에 대한 amplification을 진행할 수 있습니다.

Multiplex RT-LAMP로 세 유전자를 분석한다

이번 논문에서 사용된 amplification technology는 reverse transcription multiplex loop-mediated isothermal amplification, 즉 RT-LAMP입니다.

SARS-CoV-2의 유전물질은 RNA이므로 DNA polymerase amplification에 앞서 RNA 정보를 DNA 형태로 변환하는 reverse transcription 과정이 필요합니다.

RT-LAMP에서는 이러한 reverse transcription과 LAMP amplification을 연결할 수 있습니다.

또한 PCR처럼 반복적인 고온·저온 thermal cycling을 수행하지 않고 일정한 온도에서 amplification을 진행할 수 있다는 특징이 있습니다.

논문의 시스템에서는 RT-LAMP reaction이 63°C에서 진행됩니다.

이러한 isothermal amplification의 특징은 centrifugal microfluidic device와 결합할 때 유용합니다.

복잡한 thermal cycling module 대신 일정한 reaction temperature를 유지하는 방식으로 amplification system을 구성할 수 있기 때문입니다.

Wax로 Reaction Chamber를 막는다

RT-LAMP에서는 일정한 온도에서 반응액을 유지해야 하기 때문에 evaporation 역시 고려해야 합니다.

특히 microfluidic chamber에는 적은 양의 reaction solution이 들어가기 때문에 증발에 따른 volume 변화가 반응에 영향을 줄 수 있습니다.

연구진은 reaction chamber에 sample과 RT-LAMP cocktail이 준비된 이후 wax를 이용해 chamber를 차단했습니다.

이를 통해 RT-LAMP가 진행되는 동안 evaporation을 방지하도록 설계했습니다.

이처럼 lab-on-a-disc에서는 biochemical reaction뿐 아니라 solution 이동과 chamber sealing까지 전체 분석 과정의 일부로 설계해야 합니다.

최종 결과는 Real-Time Fluorescence로 확인한다

Reaction chamber에 도달한 RNA는 RT-LAMP amplification에 사용됩니다.

해당 chamber에 target viral RNA가 존재한다면 reverse transcription과 LAMP amplification을 거치면서 많은 양의 amplification product가 만들어집니다.

이러한 반응은 fluorescence signal의 증가로 확인할 수 있습니다.

반대로 해당 target이 존재하지 않는다면 target-dependent amplification이 나타나지 않기 때문에 동일한 fluorescence 증가가 관찰되지 않습니다.

연구진은 이를 확인하기 위해 장치에 fluorescence detector를 구성했습니다.

따라서 sample preparation과 amplification만 disc에서 진행한 뒤 별도의 실험실 분석기로 결과를 가져가는 방식이 아니라 fluorescence detection까지 하나의 portable workstation에서 수행하도록 했습니다.

Portable Workstation까지 하나의 시스템으로 구성하다

Lab-on-a-disc만으로는 자동화된 molecular analyzer가 완성되지 않습니다.

Disc를 회전시키고 reagent를 공급하며 fluorescence를 측정할 장치가 필요합니다.

연구진은 이를 위해 별도의 portable workstation을 제작했습니다.

이 장치에는

Solution storage

Solution injection system

Spinning motor

Fluorescence detector

등이 포함됩니다.

Spinning motor는 centrifugal disc의 회전을 제어합니다.

회전조건을 변화시키면 disc 내부의 solution을 다음 chamber로 이동시키는 fluidic protocol을 실행할 수 있습니다.

Injection system은 필요한 solution을 공급하고 fluorescence detector는 최종 RT-LAMP 결과를 읽습니다.

따라서 disc와 workstation이 함께 작동하면서 전체 molecular diagnostic process가 자동으로 진행됩니다.

Lab-on-a-Disc 내부 반응을 정리하면

이번 시스템의 핵심 과정을 순서대로 정리하면 다음과 같습니다.

SARS-CoV-2 Sample

→ Lysis 및 Sample Preparation

→ Centrifugal Disc Loading

→ GF/F Filter로 이동

→ Viral RNA Capture

→ First Washing

→ Second Washing

→ Elution

→ Purified RNA Collection

→ RNA Aliquoting

→ 3개의 Reaction Chamber로 분배

→ orf1ab / N / S RT-LAMP

→ Real-Time Fluorescence Detection

→ SARS-CoV-2 Target 확인

즉, 이번 기술의 핵심은 새로운 핵산 증폭 반응 하나를 개발한 것이 아닙니다.

기존에는 서로 떨어져 있던 RNA purification, reagent handling, amplification, fluorescence detection을 centrifugal microfluidics로 하나의 장치에 통합한 것​입니다.

10개 Sample과 3개 Target을 동시에 다루다

이번 연구의 high-throughput 특성도 주목할 필요가 있습니다.

Centrifugal disc에는 10개의 functional unit이 배치되어 있어 한 번의 run에서 10개의 sample을 분석할 수 있습니다.

그리고 각각의 sample은 다시 3개의 reaction chamber에서 분석됩니다.

각 chamber에서는 orf1ab, N, S gene에 대한 RT-LAMP가 진행됩니다.

따라서 단순히 10개의 동일한 reaction을 수행하는 구조가 아니라 10개 sample에 대해 각각 세 가지 viral target을 확인하는 병렬 분석 구조입니다.

연구진은 세 reaction chamber에서 나타나는 fluorescence 결과를 이용해 SARS-CoV-2 존재 여부를 판단하도록 시스템을 설계했습니다.

이러한 구조는 sample throughput과 target multiplexing을 동시에 고려한 설계라고 볼 수 있습니다.

1.5시간 안에 전체 분석을 완료하다

연구진이 제시한 시스템에서는 RNA purification부터 RT-LAMP와 fluorescence detection까지 전체 COVID-19 molecular diagnostic process를 약 1.5시간 이내에 수행할 수 있었습니다.

여기에서 1.5시간은 단순한 amplification time만을 의미하는 것이 아닙니다.

시료 준비 이후 disc에서 진행되는 RNA extraction, washing, elution, distribution, amplification과 detection이 연결된 전체 분석 시스템의 성능이라는 점이 중요합니다.

따라서 이번 논문의 성과를 단순히 ‘RT-LAMP로 SARS-CoV-2를 검출했다’고 정리하면 lab-on-a-disc가 갖는 기술적 의미를 충분히 설명하기 어렵습니다.

이번 논문에서 Lab-on-a-Disc가 중요한 이유

이번 연구에서 RT-LAMP는 SARS-CoV-2 RNA를 검출하는 핵산 증폭 기술을 담당합니다.

하지만 전체 논문의 중심은 amplification reaction 자체보다 RT-LAMP 전후의 작업을 어떻게 자동화했는가에 있습니다.

일반적인 실험실에서는 사람이 sample을 tube에 넣고 원심분리하거나 washing solution을 추가하고 RNA를 elution한 다음 다시 amplification reagent와 혼합해야 합니다.

이번 시스템에서는 이러한 작업을 disc의 chamber, channel, filter, valve와 centrifugal force를 이용해 순차적으로 진행합니다.

즉, 사람이 하던 pipetting과 sample transfer의 상당 부분을 disc의 회전과 microfluidic structure가 대신 수행하도록 만든 것입니다.

이것이 lab-on-a-disc를 단순한 작은 실험용 disc와 구분하는 중요한 특징입니다.

Point-of-Care 시스템으로서의 의미

현장형 진단기기를 개발할 때는 단순히 장비 크기를 줄이는 것만으로 충분하지 않습니다.

사용자가 수행해야 하는 복잡한 sample preparation 과정도 함께 줄여야 합니다.

특히 전문적인 검사 인프라가 제한된 환경에서는 별도의 대형 centrifuge, automated extractor, thermal cycler와 여러 pipetting step이 필요한 시스템을 운영하기 어려울 수 있습니다.

Centrifugal microfluidics는 이러한 과정을 하나의 disc와 workstation으로 통합할 수 있는 방법을 제시합니다.

이번 연구에서도 연구진은 portable genetic analyzer를 제작해 10개 sample의 RNA purification부터 RT-LAMP와 fluorescence detection까지 자동으로 처리할 수 있음을 보여주었습니다.

따라서 이 연구의 핵심은 단순한 소형화보다 분자진단 전체 과정을 통합하고 자동화하는 것에 있다고 볼 수 있습니다.

논문 리뷰를 마치며

이번 논문에서는 centrifugal lab-on-a-disc와 RT-LAMP를 결합한 SARS-CoV-2 자동 분자진단 시스템을 살펴봤습니다.

연구진은 centrifugal disc 안에 10개의 functional unit을 배치해 한 번에 10개의 sample을 처리할 수 있도록 설계했습니다.

각 sample은 GF/F filter column을 이용한 RNA capture와 반복적인 washing, elution을 거쳐 purified RNA로 회수됩니다.

이후 RNA를 세 개의 reaction chamber로 나누고 각각 orf1ab, N, S gene​을 표적으로 하는 RT-LAMP를 수행했습니다.

최종적으로 amplification 결과는 fluorescence detector를 통해 확인합니다.

전체 시스템은

RNA Purification

→ Washing

→ Elution

→ Aliquoting

→ Triplex RT-LAMP

→ Real-Time Fluorescence Detection

을 하나의 centrifugal platform에 통합했으며, 연구진은 전체 COVID-19 molecular diagnosis를 약 1.5시간에 수행할 수 있음을 제시했습니다.

결국 이 연구에서 주목할 부분은 새로운 RT-LAMP 반응 자체보다 실험실에서 사람이 단계별로 수행하던 핵산 전처리와 증폭·검출 과정을 centrifugal microfluidics를 이용해 자동화했다는 점입니다.

특히 10개 sample을 병렬로 처리하면서 각 sample에서 세 개의 SARS-CoV-2 target을 분석하도록 설계했다는 점에서 lab-on-a-disc가 sample-to-answer 분자진단 플랫폼으로 어떻게 활용될 수 있는지를 보여주는 연구라고 볼 수 있습니다.

※ 이 글은 Nguyen, Phan, Seo의 Sensors and Actuators B: Chemical 353 (2022) 131088, DOI 10.1016/j.snb.2021.131088을 바탕으로 centrifugal microfluidic molecular diagnostic system의 원리를 이해하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다.