Hi-C 분석 원리: DNA 접촉 지도로 염색체의 3차원 구조를 확인하는 방법

DNA는 세포핵 안에서 일직선으로 펼쳐져 있지 않습니다. 서로 멀리 떨어진 유전체 구간도 공간적으로 가까워질 수 있습니다. Hi-C는 이러한 DNA 구간을 연결해 접촉 빈도를 측정하는 기술입니다. 분석 원리와 접촉 지도 해석법, 암 관련 구조변이 검출의 한계를 살펴봅니다.

1. DNA에서 멀리 떨어진 유전자가 실제로는 가까울 수 있다

사람의 DNA를 염기서열 순서대로 표시하면 특정 유전자와 조절 서열 사이에 수십만 개 이상의 염기쌍이 존재할 수 있습니다.

그러나 세포핵 안의 DNA는 단백질과 결합한 염색질(Chromatin) 형태로 접혀 있습니다.

따라서 염기서열상으로 멀리 떨어진 두 DNA 구간이 실제 공간에서는 가까워질 수 있습니다.

이러한 공간적 배치는 유전자 발현 조절과 관련이 있습니다.

예를 들어 특정 유전자의 promoter와 멀리 떨어진 enhancer가 공간적으로 가까워지면 유전자 발현 조절에 영향을 줄 수 있습니다.

하지만 DNA 염기서열만 분석해서는 두 구간이 세포핵 안에서 얼마나 자주 가까워지는지 직접 확인하기 어렵습니다.

Hi-C는 이 문제를 해결하기 위해 개발된 기술입니다.

Hi-C는 세포핵 안에서 서로 가까운 DNA 구간을 연결하고, 연결된 DNA 조각을 시퀀싱해 유전체 전반의 접촉 빈도를 분석합니다.

2. Hi-C는 두 DNA 구간이 가까웠다는 사실을 어떻게 기록할까?

Hi-C의 핵심은 proximity ligation입니다.

Proximity ligation은 공간적으로 가까운 DNA 조각을 서로 연결하는 반응입니다.

일반적인 Hi-C 분석은 다음과 같은 단계로 구성됩니다.

1. 세포를 고정해 DNA와 단백질의 공간적 배치를 보존합니다.
2. 제한효소 등으로 DNA를 절단합니다.
3. 절단된 DNA 말단을 처리하고 표지합니다.
4. 공간적으로 가까운 DNA 말단을 ligation으로 연결합니다.
5. 연결된 DNA 조각을 회수해 시퀀싱합니다.
6. 두 DNA 구간이 얼마나 자주 연결됐는지 계산합니다.

이 과정에서 중요한 점은 연결된 두 DNA 조각이 원래 염기서열상으로 이웃한 구간일 필요가 없다는 사실입니다.

서로 다른 염색체에 존재하는 DNA 조각도 세포핵 안에서 가까운 위치에 있었다면 연결될 수 있습니다.

이러한 연결 정보를 대량으로 수집하면 유전체 전체의 접촉 지도를 만들 수 있습니다.

다만 Hi-C에서 연결됐다는 사실만으로 두 DNA 구간이 특정 시점에 직접 결합했다고 확정할 수는 없습니다.

고정과 절단, ligation 과정의 효율이 결과에 영향을 주기 때문입니다.

3. Hi-C Contact Map은 어떻게 읽어야 할까?

Hi-C 분석 결과는 일반적으로 contact map 또는 contact matrix로 표시합니다.

가로축과 세로축에는 유전체의 위치가 표시됩니다.

각 칸에는 두 유전체 구간 사이에서 관찰된 접촉 수 또는 정규화된 접촉 빈도가 나타납니다.

예를 들어 한 염색체를 100kb 간격으로 나눴다고 가정하겠습니다.

각 구간은 하나의 bin이 됩니다.

두 bin 사이에서 Hi-C read pair가 많이 관찰되면 해당 위치의 접촉 신호가 강하게 표시됩니다.

반대로 접촉이 적게 관찰되면 신호가 약하게 나타납니다.

Contact Map에서 대각선이 강하게 나타나는 이유

일반적으로 같은 염색체에서 서로 가까운 DNA 구간은 멀리 떨어진 구간보다 접촉할 가능성이 높습니다.

따라서 Hi-C contact map에서는 대각선 부근에 강한 접촉 신호가 나타나는 경우가 많습니다.

대각선에서 멀어질수록 접촉 빈도가 감소하는 경향이 있습니다.

하지만 이 관계는 모든 유전체 구간에서 동일하지 않습니다.

DNA가 접히는 방식과 염색질 상태, 세포 종류에 따라 특정 구간 사이에서 강한 접촉이 나타날 수 있기 때문입니다.

따라서 contact map에서 밝은 신호가 나타났다고 해서 두 DNA 구간 사이의 실제 물리적 거리를 직접 계산할 수 있는 것은 아닙니다.

4. 접촉 빈도와 실제 거리는 왜 다를까?

Hi-C는 DNA 구간 사이의 직접적인 거리를 측정하는 기술이 아닙니다.

대신 두 DNA 구간이 연결된 횟수를 측정합니다.

예를 들어 두 DNA 구간 A와 B 사이에서 500개의 접촉 read pair가 관찰됐다고 가정하겠습니다.

다른 두 구간 C와 D 사이에서는 100개의 접촉 read pair가 관찰됐습니다.

이 결과만 보면 A-B 구간의 접촉 빈도가 C-D보다 높습니다.

하지만 A와 B가 C와 D보다 정확히 5배 가까운 거리에 있다는 의미는 아닙니다.

접촉 빈도에는 여러 요인이 영향을 줍니다.

• DNA 절단 위치와 제한효소의 효율
• DNA 조각의 길이
• GC 함량과 시퀀싱 편향
• 염색질의 접근성
• 세포 집단 내 구조적 차이

따라서 Hi-C 데이터는 적절한 정규화 과정을 거쳐 해석해야 합니다.

또한 Hi-C 결과는 일반적으로 여러 세포에서 얻은 평균적인 접촉 정보를 포함합니다.

따라서 하나의 contact map을 특정 세포 하나의 고정된 3차원 구조로 해석해서는 안 됩니다.

5. 2009년 Hi-C 원천 연구에서는 무엇을 발견했을까?

2009년 Lieberman-Aiden과 연구진은 Science에 Hi-C의 원리를 발표했습니다.

연구진은 proximity ligation과 대량 병렬 시퀀싱을 결합해 사람 유전체의 공간적 접촉 지도를 제작했습니다.

당시 연구에서는 약 1Mb 해상도의 유전체 접촉 지도를 분석했습니다.

이를 통해 염색체가 세포핵 안에서 서로 다른 영역을 차지하는 chromosome territory 특성을 확인했습니다.

또한 유전체가 크게 두 종류의 공간적 구획으로 나뉘는 현상을 관찰했습니다.

이러한 구획은 이후 A/B compartment로 널리 알려졌습니다.

연구진은 유전자 발현이 활발한 영역과 상대적으로 비활성인 영역이 공간적으로 구분되는 경향을 제시했습니다.

이 연구는 유전체를 단순한 염기서열의 집합이 아니라 공간적으로 조직된 구조로 분석할 수 있음을 보여줬습니다.

6. A/B Compartment는 무엇을 의미할까?

Hi-C contact map을 분석하면 서로 비슷한 염색질 상태를 가진 유전체 구간들이 상대적으로 자주 접촉하는 패턴을 관찰할 수 있습니다.

이러한 패턴을 바탕으로 A/B compartment를 구분할 수 있습니다.

일반적으로 A compartment는 유전자 발현이 활발하고 열린 염색질 특성을 가진 영역과 관련이 있습니다.

반면 B compartment는 상대적으로 유전자 발현이 낮고 닫힌 염색질 특성을 가진 영역과 관련이 있습니다.

그러나 모든 A compartment의 유전자가 반드시 발현되는 것은 아닙니다.

또한 모든 B compartment의 유전자가 완전히 비활성인 것도 아닙니다.

A/B compartment는 개별 유전자의 발현 상태를 직접 측정한 결과가 아니라 유전체 구간 사이의 접촉 패턴을 분석해 분류한 것입니다.

따라서 실제 유전자 발현을 확인하려면 RNA-seq 등의 자료와 함께 분석하는 것이 적절합니다.

7. TAD는 유전체에서 어떤 역할을 할까?

Hi-C 분석에서는 특정 유전체 구간 내부의 DNA들이 주변 구간보다 서로 자주 접촉하는 패턴이 관찰될 수 있습니다.

이러한 영역을 Topologically Associating Domain(TAD)이라고 합니다.

TAD는 유전체의 공간적 조직을 설명하는 중요한 개념입니다.

예를 들어 특정 유전자와 enhancer가 같은 TAD 안에 존재하면 서로 접촉할 가능성이 높아질 수 있습니다.

반대로 TAD 경계가 존재하면 인접한 영역 사이의 접촉이 상대적으로 제한될 수 있습니다.

하지만 TAD 경계가 모든 세포에서 완전히 고정된 장벽으로 작용하는 것은 아닙니다.

TAD의 구조와 경계는 세포 종류와 생물학적 상태에 따라 달라질 수 있습니다.

또한 TAD가 관찰됐다는 사실만으로 해당 영역의 모든 유전자 조절 관계를 확정할 수는 없습니다.

8. 2014년 고해상도 Hi-C 연구에서 확인된 결과

2014년 Rao와 연구진은 Cell에 고해상도 in situ Hi-C 연구를 발표했습니다.

연구진은 9종류의 세포를 대상으로 유전체의 3차원 구조를 분석했습니다.

가장 높은 데이터 밀도를 가진 사람 림프모구세포 분석에서는 약 49억 개의 접촉 정보를 확보했습니다.

이를 바탕으로 1kb 수준의 해상도를 달성했습니다.

또한 약 10,000개의 chromatin loop를 확인했습니다.

연구에서 확인된 loop는 promoter와 enhancer를 연결하는 경우가 많았으며, 유전자 발현과 관련된 패턴을 나타냈습니다.

특히 많은 loop anchor에서 CTCF 결합 부위가 서로 마주 보는 방향으로 배열되는 특징이 관찰됐습니다.

이 결과는 DNA의 3차원 구조가 유전자 조절과 관련된다는 점을 보여줍니다.

그러나 해당 연구에서 보고된 1kb 해상도가 모든 Hi-C 실험에서 달성되는 것은 아닙니다.

해상도는 확보한 유효 접촉 수와 분석 대상 유전체의 크기, 데이터 품질에 영향을 받습니다.

9. Hi-C에서 염색체 전좌는 어떤 패턴으로 나타날까?

Hi-C는 염색체 사이의 접촉 정보를 분석하므로 구조변이 탐색에도 활용될 수 있습니다.

특히 염색체 전좌는 서로 다른 염색체의 DNA 구간이 연결되는 구조변이입니다.

예를 들어 정상 상태에서는 염색체 1의 특정 구간과 염색체 8의 특정 구간이 독립적으로 존재한다고 가정하겠습니다.

그런데 두 염색체 사이에서 전좌가 발생하면 원래 떨어져 있던 DNA 구간이 같은 재배열 염색체 안에서 연결될 수 있습니다.

이 경우 Hi-C contact map에서 두 염색체 구간 사이에 비정상적으로 강한 접촉 패턴이 나타날 수 있습니다.

가상의 전좌 분석 사례

정상 대조군에서는 염색체 1과 염색체 8의 특정 구간 사이에서 낮은 접촉 빈도가 관찰됐다고 가정하겠습니다.

반면 종양 검체에서는 같은 두 구간 사이에 집중된 접촉 신호가 나타났습니다.

이러한 차이는 전좌 후보를 검토할 근거가 될 수 있습니다.

하지만 서로 다른 염색체 사이의 강한 접촉 신호가 모두 전좌를 의미하는 것은 아닙니다.

정상적인 세포핵 구조에서도 서로 다른 염색체 구간이 가까이 위치할 수 있기 때문입니다.

따라서 전좌를 분석할 때는 접촉 신호의 분포와 구조변이 모델을 함께 검토해야 합니다.

필요한 경우 FISH 또는 시퀀싱 기반 방법으로 확인해야 합니다.

10. Hi-C 분석에서 구조변이 위양성이 발생하는 이유

Hi-C 데이터에서는 실제 구조변이가 없어도 비정상적인 접촉 패턴이 나타날 수 있습니다.

대표적인 원인은 다음과 같습니다.

원인	발생 가능한 문제
무작위 ligation	실제 공간적 접촉과 무관한 연결
반복서열 정렬 오류	잘못된 유전체 위치에 read 정렬
제한효소 절단 편향	특정 구간의 접촉 수 왜곡
낮은 시퀀싱 깊이	우연한 접촉 신호 증가
세포 집단의 이질성	서로 다른 구조가 혼합된 결과

특히 반복서열이 많은 유전체 영역에서는 read가 여러 위치에 정렬될 수 있습니다.

이러한 read를 적절하게 처리하지 않으면 잘못된 접촉 신호가 나타날 수 있습니다.

또한 세포 집단에 서로 다른 구조변이를 가진 세포가 혼합돼 있으면 contact map이 복잡해질 수 있습니다.

따라서 Hi-C 기반 구조변이 검출에서는 단순히 강한 접촉 신호를 찾는 것보다 정상 대조군과의 비교, 정렬 품질, 구조변이 후보의 일관성을 확인하는 것이 중요합니다.

11. Hi-C와 OGM은 무엇이 다를까?

Hi-C와 Optical Genome Mapping(OGM)은 모두 유전체 구조를 분석하지만 직접 측정하는 정보가 다릅니다.

OGM은 긴 DNA 분자에 부착된 형광 표지의 위치와 간격을 분석합니다.

반면 Hi-C는 세포핵 안에서 서로 가까운 DNA 구간의 접촉 빈도를 측정합니다.

비교 항목	Hi-C	OGM
주요 분석 정보	DNA 구간 사이의 접촉 빈도	긴 DNA의 형광 표지 배열
분석 목적	유전체 3차원 구조	유전체 구조변이
전좌 탐색	비정상 접촉 패턴 활용	DNA 배열 변화 활용
유전자 조절 분석	Enhancer-promoter 접촉 연구	직접적인 접촉 분석은 어려움
단일염기 변이	주된 분석 목적이 아님	직접 검출 불가
주요 제한 요소	접촉 편향과 정규화	DNA 길이와 표지 밀도

Hi-C는 유전체의 공간적 조직과 유전자 조절 관계를 연구하는 데 유용합니다.

OGM은 긴 DNA 분자의 물리적 배열을 분석해 구조변이를 찾는 데 유용합니다.

따라서 두 기술은 서로 대체 관계라기보다 다른 정보를 제공하는 분석법입니다.

12. Hi-C 결과에서 가장 중요한 해석 기준

Hi-C는 세포핵 안에서 DNA 구간들이 얼마나 자주 가까이 위치하는지 분석하는 기술입니다.

2009년 원천 연구에서는 유전체 전반의 접촉 지도를 제작해 A/B compartment와 같은 공간적 조직을 확인했습니다.

2014년 고해상도 연구에서는 chromatin loop와 TAD의 구조적 특성을 더 자세하게 분석했습니다.

이후 Hi-C는 유전자 발현 조절과 유전체 구조변이 연구에 활용되고 있습니다.

그러나 Hi-C에서 관찰된 접촉 빈도는 두 DNA 구간 사이의 실제 거리를 직접 의미하지 않습니다.

또한 강한 접촉 신호가 반드시 직접적인 단백질 매개 결합이나 구조변이를 의미하는 것도 아닙니다.

따라서 Hi-C 결과를 해석할 때는 데이터 정규화와 시퀀싱 깊이, 세포 집단의 특성, 다른 유전체 분석 결과를 함께 고려해야 합니다.

Hi-C의 핵심적인 가치는 DNA의 염기서열 순서만으로는 확인하기 어려운 유전체의 공간적 조직을 접촉 빈도 데이터로 분석할 수 있다는 점입니다.

이러한 특성은 유전자 조절과 염색체 구조변이의 관계를 이해하는 데 중요한 정보를 제공하지만, 특정 유전자 변이나 질환을 단독으로 확정하는 검사와는 구별해야 합니다.

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참고문헌

1. Lieberman-Aiden E, van Berkum NL, Williams L, et al. (2009).

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Hi-C 기술의 원리를 제시하고 사람 유전체의 A/B compartment를 분석한 원천 연구입니다.

2. Rao SSP, Huntley MH, Durand NC, et al. (2014).

A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.

Cell, 159(7), 1665–1680.

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고해상도 in situ Hi-C를 이용해 chromatin loop와 contact domain, CTCF 결합 방향의 특징을 분석한 연구입니다.

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Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.

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Hi-C 데이터를 이용해 포유류 유전체의 TAD 구조를 분석한 연구입니다.

4. Durand NC, Shamim MS, Machol I, et al. (2016).

Juicer Provides a One-Click System for Analyzing Loop-Resolution Hi-C Experiments.

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Hi-C 데이터 처리와 접촉 지도 분석을 위한 소프트웨어 도구를 제시한 연구입니다.

5. Harewood L, Kishore K, Eldridge MD, et al. (2017).

Hi-C as a tool for precise detection and characterisation of chromosomal rearrangements and copy number variation in human tumours.

Genome Biology, 18, 125.

DOI: https://doi.org/10.1186/s13059-017-1253-8

Hi-C를 이용해 사람 종양에서 염색체 재배열과 복제수 변이를 분석한 연구입니다.

※ 본 글은 공개된 학술논문을 바탕으로 Hi-C의 분석 원리와 연구 활용을 설명한 교육용 콘텐츠입니다. Hi-C 접촉 빈도만으로 DNA의 실제 물리적 거리나 특정 구조변이의 존재를 확정해서는 안 됩니다.