Strand-seq 원리: DNA 주형 가닥의 방향으로 염색체 역위를 찾는 방법

염색체 역위는 DNA 구간의 방향이 뒤집히는 구조변이입니다. DNA 양이 변하지 않을 수 있어 복제수 분석만으로는 발견하기 어렵습니다. Strand-seq은 세포 분열 후 남아 있는 DNA 주형 가닥을 선택적으로 분석해 역위와 자매염색분체 교환을 탐색합니다.

1. DNA 양이 정상인데도 염색체 구조가 달라질 수 있다

유전체 구조변이에는 결실, 중복, 전좌, 역위 등이 포함됩니다.

결실이나 중복은 DNA 구간의 복제수가 변하기 때문에 복제수 분석으로 확인할 수 있는 경우가 있습니다.

반면 염색체 역위(Inversion)는 DNA 구간의 방향이 뒤집힌 변이입니다.

예를 들어 정상적인 DNA 구간이 다음과 같이 배열돼 있다고 가정하겠습니다.

A — B — C — D — E

B부터 D까지의 구간이 역위되면 다음과 같이 나타날 수 있습니다.

A — D — C — B — E

DNA 구간의 전체 길이와 복제수는 그대로 유지될 수 있습니다.

따라서 DNA 양만 비교하는 분석에서는 이러한 변이를 놓칠 수 있습니다.

Strand-seq은 DNA 구간의 양이 아니라 DNA 주형 가닥의 방향 정보를 활용합니다.

이를 통해 복제수 변화가 없는 구조변이도 탐색할 수 있습니다.

2. Strand-seq은 일반적인 단일세포 NGS와 무엇이 다를까?

일반적인 단일세포 DNA 시퀀싱에서는 세포 하나에서 얻은 DNA를 증폭해 염기서열을 분석합니다.

이 과정에서는 원래 DNA가 어떤 방향의 주형 가닥에서 유래했는지에 관한 정보가 충분히 보존되지 않을 수 있습니다.

Strand-seq은 이러한 방향 정보를 유지하도록 설계된 기술입니다.

DNA 이중가닥은 서로 반대 방향으로 배열된 두 가닥으로 구성됩니다.

Strand-seq에서는 이를 기준 유전체에 대한 방향에 따라 Watson(W) 가닥과 Crick(C) 가닥으로 구분합니다.

세포가 DNA를 복제하면 기존 주형 가닥을 포함하는 두 자매염색분체가 만들어집니다.

세포 분열 후 딸세포에는 이 주형 가닥들이 분배됩니다.

Strand-seq은 딸세포 하나에서 기존 주형 가닥만 선택적으로 시퀀싱합니다.

따라서 특정 염색체 구간에서 Watson 방향의 read가 나타나는지, Crick 방향의 read가 나타나는지 확인할 수 있습니다.

이 정보가 염색체 역위와 자매염색분체 교환을 분석하는 근거가 됩니다.

3. BrdU는 새로 합성된 DNA를 어떻게 구별할까?

Strand-seq에서는 BrdU(Bromodeoxyuridine)라는 thymidine 유사체를 사용합니다.

BrdU는 DNA 복제 과정에서 새로 합성되는 DNA 가닥에 편입될 수 있습니다.

세포를 한 번의 DNA 복제 주기 동안 BrdU에 노출하면 기존 주형 가닥에는 BrdU가 포함되지 않고, 새로 합성된 가닥에는 BrdU가 포함됩니다.

DNA 복제가 완료된 뒤에는 각각의 자매염색분체에 기존 주형 가닥 하나와 새로 합성된 가닥 하나가 존재합니다.

이후 세포 분열을 거쳐 얻은 딸세포를 분리합니다.

Strand-seq의 라이브러리 제작 과정에서는 BrdU가 포함된 새 DNA 가닥이 증폭되지 않도록 처리합니다.

고전적인 방법에서는 Hoechst 염료와 자외선 처리를 이용해 BrdU가 포함된 DNA에 절단을 유도합니다.

그 결과 기존 주형 가닥에서 유래한 DNA 조각이 선택적으로 증폭됩니다.

이러한 방식으로 DNA의 원래 방향 정보를 보존할 수 있습니다.

BrdU를 사용하는 이유

BrdU는 DNA 복제 시 새로 합성된 가닥을 구별하기 위한 표지입니다.

Molecular Combing에서는 표지된 DNA 구간을 형광으로 관찰하는 데 thymidine 유사체를 활용합니다.

반면 Strand-seq에서는 새로 합성된 DNA 가닥을 분석에서 제외하기 위해 BrdU를 활용합니다.

같은 종류의 DNA 표지 물질을 사용하더라도 분석 목적은 다릅니다.

4. Watson과 Crick 가닥은 어떤 패턴으로 나타날까?

이배체 세포에는 일반적으로 각 상염색체의 상동염색체가 두 개 존재합니다.

하나는 모계에서, 다른 하나는 부계에서 유래합니다.

각 상동염색체의 주형 가닥은 세포 분열 과정에서 딸세포로 분배됩니다.

따라서 하나의 딸세포에서 특정 염색체의 두 상동염색체가 어떤 주형 가닥을 물려받았는지에 따라 세 가지 상태가 나타날 수 있습니다.

주형 가닥 상태	의미
WW	두 상동염색체에서 Watson 주형 가닥이 관찰됨
CC	두 상동염색체에서 Crick 주형 가닥이 관찰됨
WC	한 상동염색체는 Watson, 다른 상동염색체는 Crick 주형 가닥이 관찰됨

이러한 상태를 template strand state라고 합니다.

Strand-seq에서는 염색체를 여러 구간으로 나누고 각 구간에 정렬된 read의 방향을 분석합니다.

예를 들어 특정 염색체 전체에서 Watson 방향의 read만 나타난다면 WW 상태일 가능성을 검토할 수 있습니다.

반대로 Watson과 Crick 방향의 read가 함께 나타난다면 WC 상태일 가능성을 검토할 수 있습니다.

다만 실제 데이터에서는 read 수가 적거나 정렬 오류가 발생할 수 있으므로 단순히 두 방향의 read가 존재한다는 사실만으로 상태를 확정해서는 안 됩니다.

5. 염색체 역위가 있으면 방향 정보가 어떻게 달라질까?

Strand-seq에서 역위는 기준 유전체와 반대 방향으로 정렬되는 read 패턴을 통해 탐색할 수 있습니다.

예를 들어 정상 DNA에서는 특정 구간의 주형 가닥이 Watson 방향으로 정렬된다고 가정하겠습니다.

그런데 해당 구간이 역위되면 같은 DNA 구간에서 유래한 read가 기준 유전체에 대해 Crick 방향으로 정렬될 수 있습니다.

이러한 방향 전환은 역위 후보를 나타낼 수 있습니다.

가상의 Strand-seq 결과

염색체의 세 구간을 분석했다고 가정하겠습니다.

구간	기준 패턴	관찰된 패턴
1–20Mb	Watson	Watson
20–35Mb	Watson	Crick
35–50Mb	Watson	Watson

이 예시에서는 20–35Mb 구간에서 방향이 달라졌습니다.

따라서 해당 구간에 역위가 존재할 가능성을 검토할 수 있습니다.

그러나 하나의 세포에서 방향이 달라졌다는 사실만으로 역위를 확정할 수는 없습니다.

자매염색분체 교환(Sister Chromatid Exchange, SCE)도 방향 전환을 만들 수 있기 때문입니다.

또한 기준 유전체의 조립 오류나 read 정렬 오류도 비슷한 결과를 만들 수 있습니다.

따라서 여러 단일세포 라이브러리에서 같은 위치에 방향 전환이 반복적으로 나타나는지 확인해야 합니다.

6. 역위와 자매염색분체 교환은 어떻게 구별할까?

Strand-seq의 중요한 특징은 염색체 역위와 자매염색분체 교환을 모두 탐색할 수 있다는 점입니다.

하지만 두 현상은 생물학적으로 다릅니다.

역위는 DNA 구간의 방향이 바뀐 구조변이입니다.

반면 SCE는 DNA 복제 또는 손상 복구 과정에서 자매염색분체 사이에 DNA 구간이 교환되는 현상입니다.

SCE는 반드시 DNA 서열의 영구적인 구조변이를 의미하지는 않습니다.

여러 세포를 분석해야 하는 이유

특정 염색체에 유전적으로 존재하는 역위는 여러 세포에서 동일한 유전체 위치에 나타날 가능성이 있습니다.

반면 SCE는 세포마다 서로 다른 위치에서 발생할 수 있습니다.

따라서 여러 단일세포의 방향 패턴을 비교하면 반복적으로 나타나는 역위 후보와 개별 세포에서 발생한 SCE를 구별하는 데 도움이 됩니다.

물론 종양처럼 서로 다른 세포 집단이 존재하는 경우에는 일부 세포에만 구조변이가 존재할 수 있습니다.

따라서 반복 여부뿐 아니라 세포 집단의 구성과 분석 목적도 고려해야 합니다.

7. 2012년 원천 연구에서는 무엇을 확인했을까?

2012년 Falconer와 연구진은 Nature Methods에 Strand-seq의 원리를 발표했습니다.

연구진은 생쥐 배아줄기세포를 대상으로 단일세포의 DNA 주형 가닥을 분석했습니다.

이 연구에서는 세포당 평균 8개의 SCE가 관찰됐습니다.

또한 일부 SCE 위치를 최대 23bp 해상도로 좁힐 수 있었습니다.

다만 이 해상도가 모든 SCE나 구조변이에 동일하게 적용되는 것은 아닙니다.

연구진은 62개의 단일세포 Strand-seq 라이브러리를 분석해 당시 사용한 생쥐 기준 유전체(mm9)에 잘못된 방향으로 조립된 구간이 존재할 가능성도 제시했습니다.

최소 17개의 잘못된 방향의 구간이 확인됐으며, 이들의 전체 길이는 생쥐 유전체의 약 1%에 해당했습니다.

이 결과는 Strand-seq이 세포 내 DNA 재배열뿐 아니라 기준 유전체의 조립 오류를 확인하는 데도 활용될 수 있음을 보여줍니다.

8. Strand-seq으로 상동염색체를 구분할 수 있을까?

Strand-seq은 DNA의 방향 정보와 함께 상동염색체의 유전적 차이를 분석하는 데도 활용할 수 있습니다.

사람의 이배체 유전체에는 모계와 부계에서 유래한 두 상동염색체가 존재합니다.

두 상동염색체는 많은 염기서열을 공유하지만, 일부 위치에서는 서로 다른 변이를 가질 수 있습니다.

이러한 변이 정보를 이용하면 특정 DNA 구간이 어느 상동염색체에 속하는지 추정할 수 있습니다.

이 과정을 haplotype phasing이라고 합니다.

2016년 Porubský와 연구진은 Strand-seq을 이용해 염색체 길이 수준의 haplotype을 분석하는 방법을 발표했습니다.

Strand-seq은 개별 세포에서 주형 가닥의 방향과 상동염색체 정보를 보존하기 때문에 긴 유전체 구간의 haplotype을 연결하는 데 활용될 수 있습니다.

Haplotype 정보가 구조변이 분석에 중요한 이유

같은 구조변이라도 모계와 부계의 어느 상동염색체에 존재하는지에 따라 해석이 달라질 수 있습니다.

예를 들어 특정 유전자 영역에 역위가 존재한다고 가정하겠습니다.

이 역위가 한 상동염색체에만 존재하는지, 두 상동염색체 모두에 존재하는지 확인하는 것은 구조변이의 유전적 구성을 이해하는 데 중요합니다.

Strand-seq은 이러한 정보를 분석하는 데 도움이 됩니다.

그러나 정확한 염기서열 수준의 구조변이 절단점을 결정하려면 다른 시퀀싱 자료와 결합해야 할 수 있습니다.

9. Long-read Sequencing과 결합하면 무엇이 달라질까?

Strand-seq은 DNA 주형 가닥의 방향과 상동염색체 정보를 제공하지만, 단독으로 모든 염기서열을 높은 깊이로 분석하는 기술은 아닙니다.

반면 long-read sequencing은 긴 DNA 구간의 염기서열을 직접 읽을 수 있습니다.

두 기술을 결합하면 서로 다른 장점을 활용할 수 있습니다.

Strand-seq은 DNA 구간이 어느 염색체와 상동염색체에 속하는지 판단하는 데 도움이 됩니다.

Long-read sequencing은 해당 DNA 구간의 실제 염기서열을 제공할 수 있습니다.

2021년 Nature Biotechnology에 발표된 연구에서는 Strand-seq과 long-read sequencing을 결합해 부모의 유전체 자료 없이도 사람의 이배체 유전체를 haplotype별로 조립하는 방법을 제시했습니다.

이 연구는 Strand-seq의 방향 정보가 단순한 변이 검출을 넘어 유전체 조립에도 활용될 수 있음을 보여줍니다.

다만 이러한 분석에는 복잡한 생물정보학적 처리와 충분한 품질의 시퀀싱 자료가 필요합니다.

10. Strand-seq은 어떤 구조변이를 잘 검출할 수 있을까?

Strand-seq은 DNA의 방향 변화가 중요한 구조변이 분석에 유용합니다.

특히 복제수 변화가 없는 역위와 같은 변이를 탐색하는 데 장점이 있습니다.

하지만 모든 구조변이에 동일한 검출 성능을 보이는 것은 아닙니다.

분석 대상	Strand-seq의 활용 가능성	주요 제한 요소
염색체 역위	방향 전환을 이용해 탐색 가능	반복서열과 정렬 오류
자매염색분체 교환	단일세포에서 위치 분석 가능	세포별 read 수
복잡한 구조변이	다른 자료와 결합해 분석 가능	해석의 복잡성
Haplotype phasing	염색체 길이 수준으로 활용 가능	충분한 세포 수와 변이 정보
단일염기 변이	주된 분석 목적이 아님	낮은 단일세포 커버리지

특히 Strand-seq에서는 개별 세포의 유전체를 높은 깊이로 시퀀싱하지 않아도 방향 정보를 얻을 수 있습니다.

그러나 read 수가 적은 구간에서는 작은 역위를 구별하기 어려울 수 있습니다.

따라서 검출 가능한 역위의 크기와 위치는 데이터의 품질과 분석 방법에 따라 달라집니다.

11. Strand-seq에서 위양성이 발생하는 원인

Strand-seq은 DNA 방향 정보를 이용하지만, 관찰된 모든 방향 전환이 실제 구조변이를 의미하는 것은 아닙니다.

대표적인 위양성 원인은 다음과 같습니다.

기준 유전체의 조립 오류

기준 유전체에서 특정 DNA 구간이 잘못된 방향으로 조립돼 있다면 정상 DNA에서도 방향 전환이 관찰될 수 있습니다.

2012년 원천 연구에서도 이러한 문제를 확인했습니다.

따라서 분석 대상 유전체와 기준 유전체의 차이를 해석할 때는 기준 유전체의 품질을 고려해야 합니다.

반복서열에 의한 정렬 오류

유전체에는 서로 유사한 염기서열이 반복되는 구간이 존재합니다.

이러한 구간에서는 read가 잘못된 위치에 정렬될 수 있습니다.

그 결과 실제로 존재하지 않는 방향 전환이 나타날 수 있습니다.

낮은 read 수

특정 구간에 정렬된 read가 매우 적다면 Watson과 Crick 방향의 비율을 안정적으로 판단하기 어렵습니다.

따라서 분석 구간별 read 수와 정렬 품질을 함께 확인해야 합니다.

SCE와 역위의 혼동

하나의 세포에서 발생한 SCE도 방향 전환을 만들 수 있습니다.

따라서 여러 세포에서 같은 위치에 반복적으로 나타나는지 확인하는 과정이 중요합니다.

12. Strand-seq을 적용하기 어려운 검체는 무엇일까?

Strand-seq의 고전적인 실험법에서는 살아 있는 세포가 DNA를 복제하는 동안 BrdU를 편입해야 합니다.

따라서 세포 분열이 일어나지 않는 검체에서는 적용이 어렵습니다.

예를 들어 이미 추출된 혈장 cfDNA에는 세포 분열 과정에서 BrdU를 새롭게 편입시킬 수 없습니다.

따라서 일반적인 Strand-seq 방법을 혈장 cfDNA에 직접 적용할 수는 없습니다.

또한 고정된 조직에서 DNA만 추출한 경우에도 동일한 문제가 발생할 수 있습니다.

Strand-seq은 세포 배양과 DNA 복제 표지, 단일세포 분리, 라이브러리 제작 등의 과정이 필요합니다.

따라서 일반적인 혈액 기반 유전자 검사보다 실험 조건이 복잡할 수 있습니다.

이러한 특성 때문에 Strand-seq은 현재 주로 유전체 구조와 염색체 안정성을 연구하는 분야에서 활용됩니다.

임상 진단에 적용하려면 검체 처리와 분석 성능, 결과 해석에 대한 별도의 검증이 필요합니다.

13. Strand-seq과 OGM은 어떻게 구별해야 할까?

Strand-seq과 Optical Genome Mapping(OGM)은 모두 유전체 구조변이를 분석하는 기술입니다.

그러나 측정하는 정보는 다릅니다.

OGM은 긴 DNA 분자에 부착된 형광 표지의 위치와 간격을 분석합니다.

반면 Strand-seq은 세포 분열 후 남아 있는 DNA 주형 가닥의 방향을 분석합니다.

비교 기준	Strand-seq	OGM
핵심 분석 정보	Watson·Crick 주형 가닥 방향	DNA 형광 표지 배열
분석 단위	단일세포	긴 DNA 분자
주요 준비 과정	BrdU 표지와 단일세포 분리	초고분자량 DNA 추출
역위 분석	방향 전환 정보 활용	표지 배열의 방향 변화 활용
Haplotype 분석	강점이 있는 활용 분야	분석 조건에 따라 제한적
주요 제한 요소	세포 분열과 낮은 read 수	DNA 길이와 표지 밀도

두 기술 모두 복제수 변화가 없는 구조변이를 탐색할 수 있지만, 서로 다른 분석 원리를 사용합니다.

따라서 어느 기술이 항상 더 우수하다고 판단하기보다는 검체의 종류와 분석 목적에 따라 선택해야 합니다.

14. Strand-seq 결과에서 가장 중요한 것은 무엇일까?

Strand-seq은 DNA 주형 가닥의 방향을 보존해 염색체 구조를 분석하는 기술입니다.

2012년 원천 연구에서는 단일세포에서 SCE를 분석하고 기준 유전체의 잘못된 방향으로 조립된 구간을 확인했습니다.

이후 연구에서는 Strand-seq을 이용한 haplotype phasing과 유전체 조립 방법이 발전했습니다.

특히 Strand-seq은 복제수 변화가 없는 역위를 탐색하는 데 유용한 정보를 제공합니다.

그러나 단일세포에서 관찰된 방향 전환을 곧바로 구조변이로 확정해서는 안 됩니다.

SCE와 기준 유전체 오류, read 정렬 문제 등이 비슷한 패턴을 만들 수 있기 때문입니다.

따라서 여러 단일세포 라이브러리에서 방향 패턴이 반복되는지 확인하고, 필요한 경우 long-read sequencing 등 다른 분석법으로 검증해야 합니다.

Strand-seq의 핵심적인 가치는 DNA 염기서열의 양이나 길이가 아니라, 세포 분열 후 보존된 주형 가닥의 방향을 이용해 유전체 구조를 분석한다는 점입니다.

이러한 특성은 기존의 복제수 분석이나 일반적인 단일세포 시퀀싱만으로 확인하기 어려운 구조변이를 이해하는 데 도움이 됩니다.

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참고문헌

1. Falconer E, Hills M, Naumann U, et al. (2012).

DNA template strand sequencing of single-cells maps genomic rearrangements at high resolution.

Nature Methods, 9, 1107–1112.

DOI: https://doi.org/10.1038/nmeth.2206

Strand-seq의 원리를 제시하고 단일세포에서 SCE와 기준 유전체의 방향 오류를 분석한 원천 연구입니다.

2. Sanders AD, Falconer E, Hills M, et al. (2017).

Single-cell template strand sequencing by Strand-seq enables the characterization of individual homologs.

Nature Protocols, 12, 1151–1176.

DOI: https://doi.org/10.1038/nprot.2017.029

BrdU 표지와 단일세포 분리, 주형 가닥 선택적 시퀀싱, 방향 정보 분석 과정을 설명한 실험 프로토콜입니다.

3. Porubský D, Sanders AD, van Wietmarschen N, et al. (2016).

Direct chromosome-length haplotyping by single-cell sequencing.

Genome Research, 26(11), 1565–1574.

DOI: https://doi.org/10.1101/gr.206359.116

Strand-seq을 이용해 염색체 길이 수준의 haplotype을 분석하는 방법을 제시한 연구입니다.

4. Fully phased human genome assembly without parental data using single-cell strand sequencing and long reads. (2021).

Nature Biotechnology.

원문: https://www.nature.com/articles/s41587-020-0719-5

Strand-seq과 long-read sequencing을 결합해 부모의 유전체 자료 없이 이배체 유전체를 haplotype별로 조립하는 방법을 제시한 연구입니다.

5. Strand-seq: a unifying tool for studies of chromosome segregation. (2013).

Trends in Genetics.

원문: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3791154/

Strand-seq의 방향 정보와 SCE 분석, 염색체 구조 연구에 대한 활용 가능성을 설명한 검토 문헌입니다.

※ 본 글은 공개된 학술논문을 바탕으로 Strand-seq의 원리와 연구 결과를 설명한 교육용 콘텐츠입니다. 특정 연구에서 보고된 해상도와 분석 성능이 모든 구조변이 또는 세포 유형에 동일하게 적용되는 것은 아닙니다.