FFPE 조직 DNA의 가짜 C>T 변이: UDG 처리로 시퀀싱 오류를 줄이는 원리와 한계

암 조직의 NGS 분석에서 C>T 변이가 검출됐더라도 실제 체세포 변이라고 단정할 수는 없습니다. 포르말린 고정 과정에서 발생한 DNA 손상이 PCR 중 변이처럼 증폭될 수 있기 때문입니다. Uracil-DNA Glycosylase(UDG)는 이러한 오류의 일부를 줄이는 데 사용됩니다.

1. 같은 암 조직에서 분석할 때마다 다른 변이가 발견되는 이유

암 유전자 검사는 종양 조직에서 DNA를 추출하고 특정 유전자 영역을 분석하는 방식으로 수행할 수 있습니다.

이때 많은 병리 검체는 포르말린으로 고정한 뒤 파라핀에 포매하는 FFPE(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) 방식으로 보관됩니다.

FFPE는 조직의 형태를 보존하고 병리학적 관찰을 가능하게 하는 중요한 검체 처리 방법입니다. 그러나 핵산 분석에서는 DNA 절편화와 화학적 변형이 발생할 수 있다는 한계가 있습니다.

특히 낮은 빈도의 유전자 변이를 분석할 때 문제가 됩니다.

예를 들어 특정 유전자 위치에서 C>T 변이가 1% 수준으로 검출됐다고 가정해 보겠습니다.

이 변이가 실제 종양세포의 DNA에 존재한다면 중요한 체세포 변이일 수 있습니다. 반면 검체 보관 과정에서 일부 DNA가 손상되어 발생한 신호라면 실제 유전자 변이로 해석해서는 안 됩니다.

문제는 두 경우 모두 최종 sequencing 결과에서 C>T 치환으로 나타날 수 있다는 점입니다.

따라서 FFPE DNA를 분석할 때는 변이의 존재 여부뿐 아니라 검출된 염기 변화가 원본 DNA에 고정된 변이인지, 검체 처리 과정에서 발생한 손상인지 구별해야 합니다.

2. Cytosine이 Uracil로 바뀌면 왜 C>T 변이가 나타날까?

DNA에는 일반적으로 adenine(A), thymine(T), guanine(G), cytosine(C)의 네 가지 염기가 존재합니다.

Cytosine은 탈아미노화(deamination) 반응을 통해 uracil(U)로 전환될 수 있습니다.

정상적인 이중가닥 DNA에서는 cytosine이 guanine과 염기쌍을 형성합니다.

그러나 cytosine이 uracil로 변하면 원래의 C 염기쌍 구조가 달라집니다.

이후 DNA polymerase가 uracil이 포함된 가닥을 복제할 때 uracil을 thymine처럼 인식해 반대편에 adenine을 삽입할 수 있습니다.

이 과정이 반복되면 원래 C이었던 위치가 T로 바뀐 것처럼 관찰될 수 있습니다.

분석 결과에서는 이를 C>T transition으로 표현합니다.

DNA 손상과 실제 돌연변이의 차이

여기서 중요한 구분이 있습니다.

원본 DNA의 한 가닥에서 cytosine이 uracil로 바뀐 상태는 DNA 손상입니다.

반면 실제 세포의 DNA에서 C 염기쌍이 T 염기쌍으로 고정됐다면 염기서열 변이입니다.

PCR은 이 두 상태를 항상 구별하지 못합니다.

특히 손상된 DNA가 초기 PCR cycle에서 복제되면 해당 손상에서 유래한 잘못된 염기 정보가 여러 PCR product에 포함될 수 있습니다.

따라서 단순히 sequencing read 수가 많다는 이유만으로 실제 변이라고 판단해서는 안 됩니다.

3. UDG는 손상된 DNA를 어떻게 처리할까?

Uracil-DNA Glycosylase(UDG)는 DNA에 존재하는 uracil을 인식하고 제거하는 효소입니다.

Uracil-N-Glycosylase(UNG)라는 명칭도 사용됩니다.

UDG는 DNA backbone 전체를 직접 절단하는 것이 아니라 uracil 염기와 deoxyribose 사이의 N-glycosidic bond를 절단합니다.

그 결과 uracil 염기가 제거되고 해당 위치에는 염기가 없는 AP site(Abasic Site)가 남습니다.

이러한 반응은 세포 내 Base Excision Repair(BER)의 초기 단계와 관련이 있습니다.

다만 시험관에서 FFPE DNA를 UDG로 처리하는 것은 세포 내에서 일어나는 완전한 DNA 복구 과정과 다릅니다.

UDG 처리만으로 원래의 cytosine 염기가 자동으로 복원되는 것은 아닙니다.

UDG 처리 후 PCR에서는 무슨 일이 일어날까?

UDG 처리로 생성된 AP site는 많은 DNA polymerase에서 DNA 합성을 방해할 수 있습니다.

따라서 uracil 손상을 포함한 DNA 분자가 PCR에서 효율적으로 증폭되지 못할 수 있습니다.

반대로 손상되지 않은 DNA 분자는 증폭에 참여할 수 있습니다.

이러한 차이를 이용하면 uracil 손상에서 유래한 인공적인 C>T 신호를 줄일 수 있습니다.

핵심은 다음과 같습니다.

Cytosine Deamination

→ Uracil Formation

→ UDG Treatment

→ Uracil Removal

→ AP Site Formation

→ 손상 DNA의 증폭 억제

→ C>T 인공 변이 신호 감소

이 과정은 손상된 모든 DNA를 완벽하게 복구한다는 의미가 아닙니다.

오히려 특정 손상을 가진 DNA가 후속 PCR 분석에 기여하는 정도를 줄이는 방식에 가깝습니다.

4. 실제 연구에서 UDG 처리 효과는 얼마나 컸을까?

UDG의 유용성을 이해하려면 실제 FFPE 검체를 대상으로 수행한 연구를 살펴볼 필요가 있습니다.

2012년 Do와 Dobrovic 연구진은 Oncotarget에 발표한 연구에서 FFPE 암 조직의 인공적인 유전자 변이 신호를 분석했습니다.

연구진은 AKT1, BRAF, EGFR 유전자 영역에서 반복 분석 시 재현되지 않는 C>T 변이 신호를 확인했습니다.

이후 DNA를 UDG로 전처리하고 다시 PCR과 sequencing을 수행했습니다.

연구 결과, AKT1 유전자 분석에서는 UDG 처리 전 10개의 sequencing product에서 총 12개의 C>T 인공 변이가 관찰됐습니다.

반면 UDG 처리 후에는 32개의 sequencing product에서 총 7개의 인공 변이가 관찰됐습니다.

이를 sequencing product당 평균으로 비교하면 다음과 같습니다.

분석 조건	인공 변이 수	분석한 Sequencing Product	Product당 평균
UDG 처리 전	12개	10개	1.2개
UDG 처리 후	7개	32개	약 0.2개

이 결과는 해당 연구의 AKT1 분석 조건에서 UDG 전처리가 인공적인 변이 신호를 크게 줄였음을 보여줍니다.

다만 처리 전후 분석한 sequencing product 수가 다르므로 단순한 변이 개수만 비교해서는 안 됩니다.

또한 이 수치는 특정 FFPE 검체와 유전자 영역에서 얻은 결과입니다. 모든 FFPE 조직에 동일한 감소율을 적용할 수는 없습니다.

연구진은 실제 KRAS와 EGFR 변이의 검출이 유지되는지도 확인했습니다.

이러한 검증은 UDG가 인공적인 변이만 줄이는지, 실제 변이까지 검출하지 못하게 만드는지를 구분하는 데 중요합니다.

원천 연구: Do H, Dobrovic A. Dramatic reduction of sequence artefacts from DNA isolated from formalin-fixed cancer biopsies by treatment with uracil-DNA glycosylase. Oncotarget, 2012.

5. UDG를 처리해도 제거되지 않는 C>T 변이가 있다

UDG의 가장 중요한 한계 가운데 하나는 모든 C>T 관련 DNA 손상을 제거할 수 없다는 점입니다.

특히 5-methylcytosine(5mC)의 탈아미노화가 문제가 됩니다.

일반 cytosine이 탈아미노화되면 uracil이 생성됩니다.

반면 5-methylcytosine이 탈아미노화되면 thymine이 생성됩니다.

UDG는 DNA에 존재하는 uracil을 제거하지만, 정상 DNA에도 존재하는 thymine을 같은 방식으로 제거하지는 않습니다.

따라서 5mC가 thymine으로 전환되어 발생한 손상은 UDG 처리만으로 제거하기 어렵습니다.

CpG 위치에서 문제가 되는 이유

DNA의 CpG dinucleotide에는 cytosine methylation이 존재할 수 있습니다.

따라서 CpG 위치의 methylated cytosine이 탈아미노화되면 T mismatch가 발생할 수 있습니다.

이러한 손상은 후속 PCR에서 C>T 변이처럼 관찰될 수 있습니다.

2013년 Clinical Chemistry에 발표된 연구에서도 UDG 처리 후 상당수의 C>T 인공 변이가 감소했지만, CpG 위치의 일부 변화는 UDG 처리에 저항성을 보였습니다.

이 결과는 UDG가 FFPE 관련 오류를 줄이는 데 유용하지만 모든 인공 변이를 제거하는 기술은 아니라는 점을 보여줍니다.

따라서 UDG 처리 후 남은 C>T 신호를 모두 실제 체세포 변이라고 판단해서는 안 됩니다.

6. FFPE DNA가 심하게 손상된 검체에서 효과가 더 클까?

UDG의 효과는 검체의 DNA 품질에 따라 달라질 수 있습니다.

2015년 Serizawa와 연구진은 Cancer Genetics에 발표한 연구에서 보관된 FFPE 식도암 조직 126개를 분석했습니다.

연구진은 amplicon-based massively parallel sequencing을 이용해 UDG 처리 전후의 인공적인 C>T 변이를 비교했습니다.

연구 결과, DNA 절편화가 심한 검체에서는 UDG 전처리 후 C>T 변이 신호의 빈도가 약 60% 감소했습니다.

반면 DNA 품질이 양호하거나 중간 수준인 검체에서는 동일한 효과가 뚜렷하게 관찰되지 않았습니다.

이 결과는 중요한 실무적 판단 기준을 제공합니다.

UDG가 유용한지는 FFPE 검체라는 사실만으로 결정되지 않습니다.

검체의 DNA 절편화 정도와 손상 수준을 함께 평가해야 합니다.

따라서 UDG 처리 전 qPCR 기반 DNA 품질 평가 등을 수행하면 전처리 필요성을 판단하는 데 도움이 될 수 있습니다.

다만 DNA 품질 지표 하나만으로 uracil 손상의 양을 정확하게 측정할 수 있는 것은 아닙니다.

참고 연구: Serizawa M 외. The efficacy of uracil DNA glycosylase pretreatment in amplicon-based massively parallel sequencing with DNA extracted from archived formalin-fixed paraffin-embedded esophageal cancer tissues. Cancer Genetics, 2015.

7. UDG 처리가 오히려 분석에 불리한 경우도 있을까?

가능합니다.

UDG 처리는 uracil을 포함한 DNA 분자의 증폭을 억제할 수 있습니다.

하지만 검체의 DNA가 이미 심하게 절편화되어 있고 분석 가능한 분자 수가 적다면 추가적인 template 손실이 문제가 될 수 있습니다.

예를 들어 특정 유전자 영역을 포함하는 DNA 분자가 매우 적은 검체에서는 손상된 분자를 제거한 뒤 남는 template 수가 충분하지 않을 수 있습니다.

이 경우 인공적인 변이 신호는 줄어들더라도 전체 분석 민감도가 감소할 가능성이 있습니다.

따라서 UDG 전처리는 단순히 많이 사용할수록 좋은 과정이 아닙니다.

특히 저농도 DNA나 오래 보관된 FFPE 조직에서는 다음 두 요소를 함께 평가해야 합니다.

• 손상 유래 인공 변이를 얼마나 줄일 수 있는가?
• 분석 가능한 원본 DNA 분자를 얼마나 유지할 수 있는가?

이 두 요소 사이의 균형이 중요합니다.

또한 UDG가 포함된 DNA repair workflow와 단순한 UDG 전처리는 동일하지 않습니다.

다른 효소를 함께 사용하는 복구 과정에서는 AP site 처리와 DNA backbone repair가 추가될 수 있으므로 결과가 달라질 수 있습니다.

8. UDG 처리 전후 결과를 어떻게 해석해야 할까?

특정 FFPE 조직에서 낮은 빈도의 C>T 변이가 검출됐다고 가정해 보겠습니다.

UDG 처리 전에는 해당 변이가 검출되지만 처리 후에는 사라졌다면 uracil 손상에서 유래한 인공 변이일 가능성을 고려할 수 있습니다.

반대로 UDG 처리 후에도 변이가 유지된다면 실제 변이일 가능성을 검토할 수 있습니다.

하지만 이러한 결과만으로 확정적인 결론을 내릴 수는 없습니다.

UDG 처리 후 변이가 사라진 이유가 DNA 손상 제거 때문인지, 낮은 DNA input에 따른 sampling variation 때문인지 구분해야 하기 때문입니다.

또한 UDG 처리 후에도 남는 C>T 신호는 5mC deamination과 같은 다른 손상에서 유래했을 수 있습니다.

따라서 다음과 같은 분석적 근거를 함께 검토하는 것이 좋습니다.

관찰 결과	가능한 해석	추가 확인 사항
UDG 후 C>T 신호 감소	Uracil 손상 유래 오류 가능성	DNA 품질과 반복 분석
UDG 후 변이 유지	실제 변이 또는 UDG 비표적 손상	독립적인 검증
UDG 후 전체 증폭량 감소	Template 손실 가능성	DNA input 및 library yield
CpG 위치의 C>T 유지	5mC deamination 가능성	염기서열 문맥과 추가 분석
반복 실험에서 결과 불일치	낮은 분자 수 또는 손상 영향	독립적인 추출·증폭

이 표는 진단 판정 규칙이 아니라 분석 결과를 검토하기 위한 기술적 기준입니다.

9. UDG와 Duplex Sequencing을 함께 고려해야 하는 이유

UDG와 Duplex Sequencing은 모두 DNA 손상으로 인한 잘못된 변이 신호를 줄이는 데 활용할 수 있습니다.

하지만 두 기술의 작동 원리는 다릅니다.

UDG는 uracil이라는 특정 DNA 손상을 효소적으로 인식해 제거합니다.

반면 Duplex Sequencing은 원본 DNA의 양쪽 가닥을 독립적으로 분석하고 비교합니다.

따라서 UDG는 특정 화학적 손상에 대한 전처리 전략이고, Duplex Sequencing은 sequencing 결과의 오류 검증 전략입니다.

두 기술의 차이는 다음과 같습니다.

구분	UDG 전처리	Duplex Sequencing
핵심 원리	Uracil 염기 제거	원본 DNA 양가닥 비교
주요 목적	Uracil 유래 인공 변이 억제	단일가닥 손상·증폭 오류 구별
작용 단계	PCR 또는 Library Preparation 이전	Library Preparation 및 데이터 분석
주요 한계	5mC→T 손상 제거 불가	양가닥 회수율과 원본 분자 수 제한
DNA Input 영향	손상 분자의 증폭 억제 가능	양가닥 consensus 생성에 충분한 분자 필요

두 기술은 서로 대체하는 관계만은 아닙니다.

특정 분석에서는 UDG 전처리로 uracil 유래 오류를 줄이고, Duplex Sequencing으로 남아 있는 오류를 추가로 평가하는 접근도 고려할 수 있습니다.

그러나 두 기술을 결합한다고 모든 오류가 제거되거나 검출한계가 자동으로 개선되는 것은 아닙니다.

실제 검체에서는 DNA 손실과 분석 비용, library complexity를 함께 평가해야 합니다.

10. 실제 FFPE 유전자 검사에서 중요한 판단 기준

UDG를 사용할지 결정할 때는 다음과 같은 질문이 중요합니다.

첫째, 검체가 FFPE 조직인지 확인해야 합니다.

둘째, DNA 절편화와 손상 정도를 평가해야 합니다.

셋째, 분석하려는 변이가 C>T 또는 G>A 계열인지 확인해야 합니다.

넷째, 검출하려는 변이의 VAF가 낮아 손상 유래 오류와 구별하기 어려운지 판단해야 합니다.

다섯째, UDG 처리 후 충분한 원본 DNA 분자가 유지되는지 확인해야 합니다.

이러한 조건을 검토하면 모든 FFPE 검체에 동일한 전처리를 적용하는 것보다 분석 목적에 적합한 방법을 선택할 수 있습니다.

특히 낮은 VAF의 변이가 치료 관련 바이오마커로 사용되는 경우에는 단순한 read count뿐 아니라 검체 품질과 분석법의 검증 수준이 중요합니다.

또한 실제 임상 검사에서는 검사실에서 검증한 표준작업절차와 품질관리 기준을 따라야 합니다.

11. UDG가 분자진단에서 갖는 의미

UDG는 DNA를 증폭하거나 특정 유전자 변이를 직접 인식하는 기술이 아닙니다.

오히려 검체에 존재하는 특정 DNA 손상을 제거해 후속 분석의 신뢰도를 높이는 효소적 전처리 방법입니다.

이러한 점에서 PCR과 NGS의 성능을 평가할 때 중요한 관점을 제공합니다.

변이 검출에서 문제가 되는 것은 sequencing 장비의 염기 판독 오류만이 아닙니다.

DNA가 추출되기 이전부터 존재하던 화학적 손상도 최종 분석 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

특히 FFPE 조직처럼 검체 처리 과정에서 DNA 손상이 발생할 수 있는 환경에서는 이러한 영향을 구분해야 합니다.

2012년과 2013년의 연구에서는 UDG 전처리로 C>T 인공 변이 신호를 크게 줄일 수 있음을 보여줬습니다.

반면 2015년 연구에서는 UDG 효과가 DNA 품질에 따라 달라질 수 있다는 점을 제시했습니다.

이 결과들을 종합하면 UDG는 모든 FFPE 검체에 무조건 적용해야 하는 보편적인 해결책이 아니라, 검체의 손상 특성과 분석 목적을 고려해 선택해야 하는 전처리 기술입니다.

결론: C>T 변이가 보인다고 모두 실제 유전자 변이는 아니다

FFPE 조직에서 검출되는 일부 C>T 변이는 cytosine deamination으로 발생한 DNA 손상에서 유래할 수 있습니다.

이러한 손상은 PCR 과정에서 복제되면서 실제 유전자 변이와 유사한 신호를 생성할 수 있습니다.

UDG는 uracil을 제거해 이러한 인공적인 변이 신호를 줄이는 데 도움을 줍니다.

하지만 5-methylcytosine이 thymine으로 전환된 손상은 UDG로 제거하기 어렵습니다.

또한 UDG 전처리로 분석 가능한 DNA 분자가 감소할 가능성도 있으므로 검체의 DNA 품질을 함께 평가해야 합니다.

UDG의 핵심적인 가치는 새로운 변이를 더 많이 검출하는 것이 아니라, 실제 변이처럼 보이는 특정 DNA 손상 유래 오류를 줄여 분석 결과의 신뢰도를 높이는 데 있습니다.

따라서 FFPE DNA에서 낮은 빈도의 C>T 변이가 발견됐다면, 단순한 VAF 수치보다 검체 처리 이력과 DNA 품질, UDG 처리 여부, 반복 분석 결과를 함께 확인하는 것이 중요합니다.

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참고문헌

1. Do H, Dobrovic A. (2012).

Dramatic reduction of sequence artefacts from DNA isolated from formalin-fixed cancer biopsies by treatment with uracil-DNA glycosylase.

Oncotarget.

DOI: https://doi.org/10.18632/oncotarget.503

FFPE 조직의 uracil 손상과 인공적인 C>T 변이의 관계를 분석하고 UDG 전처리 효과를 확인한 원천 연구입니다.

2. Do H, Dobrovic A. (2013).

Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates.

Clinical Chemistry.

PubMed: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23649127/

UDG 전처리가 amplicon-based NGS에서 인공적인 C>T 변이 신호를 줄이는 데 미치는 영향을 평가했습니다.

3. Serizawa M, Yokota T, Hosokawa A, et al. (2015).

The efficacy of uracil DNA glycosylase pretreatment in amplicon-based massively parallel sequencing with DNA extracted from archived formalin-fixed paraffin-embedded esophageal cancer tissues.

Cancer Genetics, 208(9), 415–427.

DOI: https://doi.org/10.1016/j.cancergen.2015.05.001

126개의 FFPE 식도암 검체를 분석해 DNA 품질에 따른 UDG 처리 효과를 비교한 연구입니다.

4. Chen G, Mosier S, Gocke CD, et al. (2014).

Cytosine Deamination is a Major Cause of Baseline Noise in Next Generation Sequencing.

Molecular Diagnosis & Therapy.

PubMed: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25091469/

NGS에서 관찰되는 C>T background signal과 cytosine deamination의 관계를 분석했습니다.

※ 본 글은 공개된 학술논문을 바탕으로 FFPE DNA의 손상 유래 오류와 UDG 전처리 원리를 설명한 교육용 콘텐츠입니다. 특정 검체의 변이 판정이나 임상적 해석에는 검증된 검사 절차와 전문적인 평가가 필요합니다.