5-Hydroxymethylcytosine을 활용한 액체생검 암 바이오마커 검출 기술

5-Hydroxymethylcytosine(5hmC)은 DNA cytosine에 형성되는 epigenetic modification입니다. 혈액 속 cfDNA의 5hmC 분포를 분석하면 염기서열이나 mutation만으로는 얻기 어려운 조직의 유전자 조절 상태와 질환 관련 변화를 조사할 수 있습니다.

5hmC는 DNA 염기 자체가 바뀐 Mutation일까?

DNA에는 adenine, thymine, guanine과 cytosine이 존재합니다.

암 유전체 분석에서는 특정 위치의 nucleotide가 다른 nucleotide로 변한 mutation을 찾는 경우가 많습니다.

하지만 5-Hydroxymethylcytosine은 이러한 sequence mutation과 다릅니다.

Cytosine을 기반으로 하는 chemical modification입니다.

따라서 동일한 DNA sequence를 가진 두 molecule이라도 한쪽은 unmodified cytosine을, 다른 쪽은 modified cytosine을 가질 수 있습니다.

즉, 5hmC 분석에서 중요한 질문은

어떤 염기가 존재하는가

뿐 아니라

그 염기가 어떤 화학적 상태에 있는가

입니다.

이것이 sequence variation과 epigenetic modification의 중요한 차이입니다.

5mC와 5hmC는 어떤 관계일까?

5hmC를 이해하려면 먼저 5-methylcytosine(5mC)을 알아야 합니다.

DNA methylation에서는 cytosine의 5번 탄소 위치에 methyl group이 추가되어 5mC가 형성될 수 있습니다.

TET(Ten-Eleven Translocation) family enzyme은 5mC를 산화할 수 있습니다.

그 첫 번째 산화 산물이 **5-hydroxymethylcytosine(5hmC)**입니다.

개념적으로는

Cytosine

→ 5-Methylcytosine

→ 5-Hydroxymethylcytosine

으로 연결할 수 있습니다.

TET enzyme은 5hmC를 추가적으로 산화해 5-formylcytosine(5fC), 5-carboxylcytosine(5caC)으로 전환할 수도 있습니다.

따라서 5hmC는 DNA demethylation과 관련된 pathway의 intermediate로 볼 수 있는 동시에 자체적인 epigenetic mark로도 연구됩니다.

5hmC는 단순한 5mC의 중간산물만은 아니다

처음에는 5hmC가 DNA demethylation 과정에서 잠시 존재하는 intermediate로 주로 설명되기도 했습니다.

하지만 여러 tissue에서 5hmC가 안정적으로 존재하며 특정 genomic region과 gene regulatory state에 연관될 수 있다는 사실이 알려졌습니다.

특히 tissue와 cell type에 따라 5hmC distribution이 다를 수 있습니다.

따라서 5hmC pattern은 원래 DNA가 어떤 biological environment에서 유래했는지를 추정하는 정보로 연구되고 있습니다.

액체생검에서는 이 특성을 이용해 혈액 속 cfDNA에서 tissue-associated 또는 disease-associated 5hmC signature를 찾습니다.

cfDNA에서 5hmC를 보는 이유

Cell-free DNA(cfDNA)는 여러 세포에서 유래한 DNA fragment가 혈액에 섞여 있는 population입니다.

암 환자에서는 이 가운데 일부가 tumor-derived DNA일 수 있습니다.

Mutation 기반 liquid biopsy는 tumor DNA에 특정 mutation이 존재해야 해당 신호를 직접 찾을 수 있습니다.

반면 epigenetic alteration은 mutation과 다른 차원의 정보를 제공합니다.

Tumorigenesis 과정에서는 gene regulation과 chromatin state가 크게 변할 수 있습니다.

이와 함께 DNA methylation과 hydroxymethylation pattern도 달라질 수 있습니다.

따라서 cfDNA의 5hmC distribution을 분석하면 tumor-associated epigenetic change를 포착할 가능성이 있습니다.

5hmC는 Genome 전체에 동일하게 분포할까?

그렇지 않습니다.

5hmC는 genomic position에 따라 서로 다른 수준으로 나타날 수 있습니다.

Gene body와 regulatory region 등에서 특징적인 distribution이 연구되어 왔으며 tissue와 cell state에 따라서도 차이가 나타날 수 있습니다.

따라서 액체생검에서 단순히

혈액에 5hmC가 얼마나 있는가

만 측정하는 것보다

어느 genomic region에서 5hmC가 증가하거나 감소했는가

를 분석하는 것이 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다.

이러한 genome-wide pattern을 이용해 질환과 연관된 signature를 찾을 수 있습니다.

암에서는 5hmC가 무조건 감소할까?

일부 암과 tissue에서는 global 5hmC level 감소가 관찰된 연구들이 있습니다.

하지만 이를 모든 암에서 모든 genomic region의 5hmC가 동일하게 감소한다고 일반화해서는 안 됩니다.

특정 region에서는 상대적인 enrichment가 나타날 수 있고 cancer type과 stage, cell composition에 따라 pattern이 달라질 수 있습니다.

액체생검에서는 global amount 하나보다 genome-wide differential 5hmC pattern을 분석하는 접근이 중요한 이유입니다.

5mC와 5hmC를 구별하기 어려운 이유

두 modification은 chemical structure가 매우 비슷합니다.

5mC에는 methyl group이 있고 5hmC에는 hydroxymethyl group이 존재합니다.

문제는 일부 전통적인 DNA methylation 분석법이 이 둘을 동일하게 읽을 수 있다는 것입니다.

대표적인 예가 conventional bisulfite sequencing입니다.

Bisulfite treatment에서는 일반적인 unmodified cytosine은 변환되지만 5mC와 5hmC는 모두 cytosine signal로 남을 수 있습니다.

따라서 일반 bisulfite sequencing 결과만으로는 해당 위치가 5mC인지 5hmC인지 직접 구별하기 어렵습니다.

5hmC-specific analysis에는 별도의 chemical 또는 enzymatic discrimination strategy가 필요합니다.

Bisulfite Treatment는 무엇을 하는가?

Conventional bisulfite treatment에서는 unmodified cytosine이 chemical conversion을 거쳐 sequencing에서 thymine으로 읽히도록 할 수 있습니다.

반면 5mC는 이러한 conversion에 상대적으로 저항해 cytosine으로 읽힙니다.

이 차이를 이용하면 DNA methylation을 분석할 수 있습니다.

하지만 5hmC 역시 conventional bisulfite 조건에서 5mC와 구별되지 않는 방향으로 읽힐 수 있습니다.

따라서

C → T로 판독

5mC → C로 판독

5hmC → 역시 C로 판독 가능

이라는 문제가 발생합니다.

즉, conventional bisulfite sequencing에서 관찰한 modified-cytosine signal에는 5mC와 5hmC가 함께 포함될 수 있습니다.

Oxidative Bisulfite Sequencing은 어떻게 구별할까?

5mC와 5hmC를 구별하기 위한 방법 가운데 하나가 **oxidative bisulfite sequencing(oxBS-seq)**입니다.

이 접근에서는 5hmC를 먼저 선택적으로 산화해 bisulfite treatment에 다르게 반응하도록 만듭니다.

그 결과 oxBS 조건에서는 5mC와 5hmC의 판독 결과를 분리할 수 있습니다.

일반 bisulfite 결과와 oxidative bisulfite 결과를 비교하면 5hmC contribution을 추정할 수 있습니다.

다만 이러한 conversion 기반 방식은 DNA 손실과 degradation을 고려해야 합니다.

cfDNA처럼 시작 물질이 적은 liquid biopsy에서는 이러한 문제가 특히 중요합니다.

TAB-Seq는 어떤 원리를 사용할까?

5hmC를 선택적으로 분석하는 또 다른 접근으로 **TET-assisted bisulfite sequencing(TAB-seq)**이 개발되었습니다.

개념적으로 5hmC를 glucosylation으로 보호하고 다른 modified cytosine을 TET-mediated oxidation에 노출시키는 방식으로 5hmC를 구별할 수 있습니다.

이후 bisulfite conversion과 sequencing을 이용해 5hmC 위치를 분석합니다.

이 방식은 base-resolution 5hmC mapping에 활용될 수 있습니다.

하지만 여러 enzymatic·chemical processing 단계가 필요하므로 적은 양의 cfDNA를 분석할 때 recovery와 conversion efficiency가 중요합니다.

Liquid Biopsy에서는 왜 Enrichment 방식이 유용할까?

혈장 cfDNA 양은 제한적이며 그중 5hmC-containing fragment는 더 작은 fraction일 수 있습니다.

Genome 전체의 모든 cytosine을 base resolution으로 읽는 것은 많은 sequencing resource를 요구할 수 있습니다.

따라서 5hmC가 포함된 DNA fragment를 선택적으로 labeling하고 enrichment한 뒤 sequencing하는 전략이 개발되었습니다.

이러한 방식에서는 5hmC-containing cfDNA fragment를 상대적으로 농축해 genome-wide distribution을 분석할 수 있습니다.

특히 low-input cfDNA를 다루는 liquid biopsy 연구에서 관심을 받는 이유입니다.

5hmC-Seal은 어떤 원리일까?

5hmC enrichment에 사용되는 대표적인 접근 가운데 하나가 5hmC-Seal 계열의 방법입니다.

핵심은 5hmC를 enzymatically 선택적으로 labeling하는 것입니다.

T4 bacteriophage의 β-glucosyltransferase(βGT)는 5hmC에 glucose moiety를 전달할 수 있습니다.

이 반응에 chemically functionalized glucose donor를 사용하면 5hmC 위치에 추가적인 reactive handle을 도입할 수 있습니다.

그 다음 click chemistry 등을 이용해 biotin 같은 affinity tag를 연결할 수 있습니다.

즉,

5hmC-containing DNA

→ βGT-Mediated Selective Labeling

→ Chemical Handle Introduction

→ Biotin Conjugation

→ Affinity Enrichment

→ Sequencing

으로 연결할 수 있습니다.

Biotin을 붙이는 이유

Biotin은 streptavidin과 매우 강하게 결합합니다.

5hmC-containing DNA에 biotin tag를 선택적으로 도입하면 streptavidin-coated bead를 이용해 해당 fragment를 포획할 수 있습니다.

5hmC가 없는 fragment는 상대적으로 제거되고 5hmC-containing DNA가 enrichment됩니다.

이후 captured DNA를 sequencing library로 분석하면 5hmC가 존재했던 genomic region을 찾을 수 있습니다.

따라서 5hmC-Seal은 DNA 전체를 동일하게 sequencing하는 것이 아니라 5hmC 정보를 가진 fragment를 선택적으로 농축해 읽는 전략이라고 볼 수 있습니다.

Enrichment Sequencing은 Base Resolution일까?

반드시 그렇지는 않습니다.

5hmC-containing fragment를 포획한 뒤 sequencing하면 어떤 genomic region에 5hmC signal이 enrichment되어 있는지 알 수 있습니다.

하지만 fragment 안의 정확히 어느 cytosine이 5hmC였는지까지 항상 직접 결정하는 것은 아닙니다.

즉,

Region-Level Enrichment

와

Single-Base 5hmC Mapping

은 구분해야 합니다.

Liquid biopsy biomarker discovery에서는 모든 cytosine의 정확한 위치보다 gene이나 genomic region 수준의 5hmC enrichment pattern이 유용한 경우도 있습니다.

5hmC Signal은 어떻게 정량할까?

Enriched fragment를 sequencing하고 reference genome에 mapping하면 각 genomic region에서 read abundance를 계산할 수 있습니다.

예를 들어 특정 gene body에 mapping되는 5hmC-enriched fragment 수를 측정할 수 있습니다.

Cancer group과 control group에서 normalized read count를 비교하면 differential 5hmC region 또는 gene을 찾을 수 있습니다.

이렇게 만들어진 수많은 feature 가운데 disease discrimination에 유용한 pattern을 선택할 수 있습니다.

따라서 최종 biomarker는 단일 5hmC molecule이 아니라 여러 genomic region의 hydroxymethylation profile이 될 수 있습니다.

Gene Body 5hmC가 관심을 받는 이유

5hmC는 일부 tissue에서 transcriptionally active한 gene body와 연관된 pattern을 보일 수 있습니다.

따라서 cfDNA에서 특정 gene 영역의 5hmC signal이 달라지면 원래 세포의 gene regulatory state와 관련된 정보를 제공할 가능성이 있습니다.

이러한 특징은 단순 mutation 분석과 다릅니다.

Mutation은 DNA sequence 자체의 변화를 확인합니다.

5hmC profile은 동일한 sequence 위에 형성된 epigenetic state를 분석합니다.

따라서 특정 mutation이 없는 환자에서도 disease-associated epigenetic pattern을 연구할 수 있습니다.

Tissue of Origin을 추정할 수 있을까?

각 tissue는 서로 다른 gene expression과 epigenetic landscape를 가집니다.

따라서 5hmC distribution 역시 tissue-specific feature를 일부 가질 수 있습니다.

혈장 cfDNA의 5hmC pattern을 reference tissue profile과 비교하면 cfDNA가 어느 tissue에서 유래했는지를 추정하는 연구가 가능합니다.

암 액체생검에서는 이를 이용해

암 관련 signal이 존재하는가

뿐 아니라

어느 tissue에서 발생한 signal일 가능성이 있는가

를 함께 분석하려는 접근이 연구됩니다.

하지만 tissue-of-origin prediction은 확률적인 분석이며 단일 5hmC marker만으로 조직 기원을 확정한다고 일반화해서는 안 됩니다.

초기 암 검출에서는 왜 Epigenetic Signal을 보는가?

Early-stage tumor에서는 혈액으로 방출되는 ctDNA fraction이 매우 낮을 수 있습니다.

특정 mutation 하나만 추적하면 해당 mutation을 포함한 molecule 자체를 확보하지 못할 수 있습니다.

Epigenetic approach에서는 여러 genomic region에 걸쳐 나타나는 cancer-associated pattern을 함께 분석할 수 있습니다.

따라서 하나의 mutation locus보다 넓은 signal space를 활용할 가능성이 있습니다.

하지만 tumor-derived cfDNA가 극도로 적다면 5hmC 역시 정상 세포 유래 cfDNA background 안에 묻힐 수 있습니다.

Epigenetic marker라고 해서 low tumor fraction 문제가 자동으로 해결되는 것은 아닙니다.

5hmC와 DNA Methylation 검사는 같은 검사일까?

두 분석 모두 epigenetics에 속하지만 측정 대상은 다릅니다.

구분	5mC 분석	5hmC 분석
Modification	5-Methylcytosine	5-Hydroxymethylcytosine
생물학적 관계	DNA methylation의 주요 형태	5mC oxidation과 연관된 modification
Conventional bisulfite	검출 가능	5mC와 직접 구별 어려움
선택적 분석	다양한 methylation assay	oxBS, TAB-seq, enrichment 등 필요
Liquid biopsy 정보	Methylation pattern	Hydroxymethylation pattern

두 modification은 관련되어 있지만 동일한 biomarker는 아닙니다.

5hmC와 Fragmentomics를 함께 보면 무엇이 달라질까?

앞서 살펴본 fragmentomics는 cfDNA가 어떤 길이와 절단 위치를 갖는지 분석합니다.

5hmC는 DNA fragment 위의 chemical modification을 분석합니다.

따라서 하나의 cfDNA molecule에서 서로 다른 정보 층을 얻을 수 있습니다.

Sequence → 어떤 염기인가

Mutation → Reference와 어떻게 다른가

Methylation/Hydroxymethylation → 어떤 chemical modification이 있는가

Fragmentomics → DNA가 어떤 형태로 잘렸는가

이러한 feature를 함께 분석하는 multi-modal liquid biopsy가 연구될 수 있습니다.

Mutation과 5hmC를 결합할 수도 있다

특정 cancer mutation이 검출되면 강한 tumor-associated evidence가 될 수 있습니다.

하지만 모든 환자에서 동일한 mutation이 나타나는 것은 아닙니다.

반면 5hmC profile은 genome-wide epigenetic change를 분석할 수 있습니다.

따라서 mutation과 5hmC를 결합하면 서로 다른 biological information을 이용할 수 있습니다.

예를 들어 mutation-positive sample에서는 sequence-level evidence를 얻고 5hmC pattern에서는 tissue-associated information을 추가로 분석할 수 있습니다.

이러한 multi-analyte approach는 하나의 biomarker만 사용하는 것과 다른 전략입니다.

5hmC와 cfDNA Fragment Length도 연결될까?

5hmC 분석에 사용되는 대상 역시 cfDNA fragment이므로 fragment size와 library preparation의 영향을 받을 수 있습니다.

특정 크기의 DNA가 extraction이나 sequencing 과정에서 선택적으로 손실되면 관찰되는 5hmC profile 역시 달라질 수 있습니다.

따라서 epigenetic analysis라고 해서 fragment-level technical bias에서 자유로운 것은 아닙니다.

cfDNA extraction method와 size selection, adapter ligation efficiency 등을 함께 관리해야 합니다.

Sample Preparation이 특히 중요한 이유

혈액에서 cfDNA를 분석하려면 먼저 plasma를 안정적으로 분리해야 합니다.

채혈 후 processing이 지연되면 blood cell에서 genomic DNA가 방출될 수 있습니다.

High-molecular-weight genomic DNA가 섞이면 원래 cfDNA population이 희석되고 epigenetic profile에도 영향을 줄 수 있습니다.

따라서

Blood Collection

Processing Time

Centrifugation

Storage

Freeze-Thaw

같은 pre-analytical condition을 관리해야 합니다.

5hmC처럼 상대적으로 희귀한 modification을 분석할 때는 이러한 variation이 더욱 중요할 수 있습니다.

Low-Input DNA에서는 Recovery가 중요하다

cfDNA는 tissue genomic DNA에 비해 얻을 수 있는 양이 제한적입니다.

5hmC enrichment 과정에서 DNA가 손실되면 최종 library complexity가 감소할 수 있습니다.

특정 fragment만 우연히 남으면 원래 biological profile이 왜곡될 수도 있습니다.

따라서 low-input assay에서는 높은 labeling specificity뿐 아니라 DNA recovery와 library complexity를 함께 평가해야 합니다.

매우 강한 enrichment가 항상 정확한 quantification을 의미하지 않는 이유입니다.

PCR Amplification Bias도 고려해야 한다

Enrichment 후 sequencing library를 PCR로 증폭할 수 있습니다.

이 과정에서 GC content나 fragment length에 따라 amplification efficiency가 달라질 수 있습니다.

특정 fragment가 더 잘 증폭되면 원래 5hmC abundance와 sequencing read count 사이에 차이가 생길 수 있습니다.

따라서 bioinformatics normalization과 technical control이 필요합니다.

PCR duplicate를 어떻게 처리하는지도 분석 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

5hmC Pattern 분석에 Machine Learning이 사용되는 이유

Genome 전체에서 5hmC signal을 측정하면 수천 개 이상의 gene 또는 genomic region이 feature가 될 수 있습니다.

단일 marker만으로 cancer와 control을 구분하기보다 여러 feature의 조합을 사용하는 방법이 연구됩니다.

예를 들어

Gene A 5hmC 증가

Gene B 5hmC 감소

Region C Pattern 변화

같은 여러 정보를 동시에 model에 입력할 수 있습니다.

Machine-learning classifier는 이러한 multidimensional pattern을 이용해 sample group을 분류할 수 있습니다.

그러나 높은 training accuracy만으로 임상적 유용성을 판단해서는 안 됩니다.

Independent Validation이 필요한 이유

수천 개의 epigenetic feature에서 일부 marker를 선택하면 우연히 특정 cohort를 잘 구분하는 pattern이 만들어질 수 있습니다.

특히 sample 수가 적고 feature 수가 많으면 overfitting 위험이 높아집니다.

따라서 biomarker discovery에 사용하지 않은 독립적인 sample에서 model을 평가해야 합니다.

Age와 sex, smoking, inflammation, liver function 등 cfDNA composition과 epigenetic profile에 영향을 줄 수 있는 요소도 고려할 필요가 있습니다.

암 환자와 건강인만 비교한 결과가 실제 screening population에서 그대로 재현된다고 가정해서는 안 됩니다.

특정 암에서 발견된 5hmC Marker가 다른 암에도 적용될까?

암종마다 tissue origin과 molecular biology가 다릅니다.

따라서 특정 cancer cohort에서 발견된 5hmC signature가 다른 cancer type에서도 동일한 방향으로 나타난다고 보장할 수 없습니다.

같은 암종 안에서도 subtype과 stage에 따라 차이가 발생할 수 있습니다.

따라서 5hmC biomarker는

Cancer Type

Disease Stage

Patient Population

Sample Processing Method

을 명확히 정의해 검증해야 합니다.

치료 반응 Monitoring에도 사용할 수 있을까?

Tumor burden이 변하면 혈액 속 tumor-associated cfDNA fraction과 molecular profile도 달라질 가능성이 있습니다.

따라서 치료 전후의 5hmC signature 변화를 추적해 treatment response와의 관계를 연구할 수 있습니다.

하지만 특정 5hmC signal 감소가 곧바로 tumor regression을 의미한다고 일반화할 수는 없습니다.

cfDNA의 tissue contribution과 treatment-induced cell death 등 여러 biological factor가 영향을 줄 수 있기 때문입니다.

Monitoring biomarker로 사용하려면 longitudinal sample에서 별도의 임상 검증이 필요합니다.

Nanopore로 5hmC를 읽을 수도 있을까?

앞서 살펴본 nanopore sequencing에서는 DNA가 pore를 통과할 때 local nucleotide environment에 따라 ionic current가 달라집니다.

Chemical modification 역시 current pattern에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 nanopore signal에서 5mC와 5hmC 같은 modified base를 구별하려는 연구가 가능합니다.

이 접근은 chemical conversion 없이 native DNA modification을 분석할 가능성이 있다는 점에서 흥미롭습니다.

하지만 실제 discrimination 성능은 pore chemistry와 sequencing condition, basecalling model 및 training data에 의존합니다.

따라서 nanopore가 모든 5hmC를 자동으로 정확하게 읽는다고 일반화해서는 안 됩니다.

5hmC 검출 기술의 차이를 정리하면

5hmC 분석에는 목적에 따라 서로 다른 접근이 사용될 수 있습니다.

oxBS 계열

5mC와 5hmC의 chemical response 차이를 이용합니다.

TAB-Seq 계열

5hmC를 선택적으로 보호하고 다른 cytosine modification과 구별하는 전략을 사용합니다.

Affinity Enrichment

5hmC를 선택적으로 labeling한 뒤 해당 DNA fragment를 농축합니다.

Nanopore 등 Single-Molecule Analysis

Native DNA에서 modification-dependent electrical signal을 직접 해석하는 방향이 연구됩니다.

따라서 ‘5hmC 검사’라고 하더라도 어떤 방법을 사용했는지에 따라 얻을 수 있는 정보의 해상도와 의미가 달라집니다.

5hmC Liquid Biopsy의 전체 분석 과정

Enrichment sequencing을 예로 들면 다음과 같이 정리할 수 있습니다.

Blood Collection

→ Plasma Separation

→ cfDNA Extraction

→ 5hmC-Selective Labeling

→ Affinity Tag Conjugation

→ 5hmC-Containing Fragment Enrichment

→ Sequencing Library Preparation

→ Sequencing

→ Genome Mapping

→ 5hmC Feature Quantification

→ Cancer-Associated Pattern Analysis

여기에서 핵심은 DNA를 많이 증폭하는 것보다 5hmC 정보를 가진 fragment를 선택적으로 구별하고 그 genomic distribution을 정량하는 것입니다.

5hmC 분석은 핵산 증폭 기술이 아니다

5hmC detection을 PCR이나 RCA 같은 nucleic acid amplification과 혼동해서는 안 됩니다.

5hmC labeling과 enrichment는 특정 chemical modification을 가진 DNA를 선택하는 과정입니다.

PCR은 필요한 경우 sequencing library를 증폭하기 위해 사용될 수 있지만 5hmC 자체를 만들어내거나 선택적으로 복제하는 것은 아닙니다.

따라서

5hmC Labeling → Epigenetic Selection

PCR → Library Amplification

Sequencing → Genomic Location Reading

Bioinformatics → Pattern Interpretation

으로 역할을 구분할 수 있습니다.

기존 액체생검 Biomarker와 비교하면

분석 대상	주요 정보	대표적인 특징
ctDNA Mutation	Sequence alteration	특정 유전자 변이 확인
cfDNA Methylation	5mC pattern	Epigenetic tissue·disease signal
cfDNA 5hmC	Hydroxymethylation pattern	5mC와 다른 epigenetic layer
Fragmentomics	Fragment length·end pattern	DNA 절단·chromatin 관련 정보
EV-miRNA	Vesicle-associated RNA	RNA cargo 변화 분석

이들은 서로 경쟁하는 하나의 검사라기보다 서로 다른 biological layer를 분석하는 기술입니다.

5hmC가 액체생검에서 갖는 의미

암 액체생검에서 DNA를 분석한다고 하면 mutation을 먼저 떠올리기 쉽습니다.

하지만 DNA에는 nucleotide sequence 외에도 여러 정보가 존재합니다.

5hmC는 그중 하나인 epigenetic information입니다.

같은 nucleotide sequence라도 tissue와 cell state에 따라 hydroxymethylation pattern이 달라질 수 있습니다.

따라서 cfDNA 5hmC 분석은 혈액에 떠다니는 DNA를 단순한 mutation carrier로 보는 것이 아니라 원래 세포의 gene regulation과 epigenetic state 일부를 기록한 molecule로 해석하는 접근입니다.

특히 genome-wide 5hmC distribution을 이용하면 특정 mutation 하나를 찾는 것과 다른 방식으로 disease-associated signature를 조사할 수 있습니다.

마치며

5-Hydroxymethylcytosine은 5mC가 TET enzyme에 의해 산화되면서 형성될 수 있는 DNA modification이며 tissue와 cell state에 따라 특징적인 genomic distribution을 나타낼 수 있습니다.

액체생검에서는 혈장 cfDNA에 존재하는 5hmC를 선택적으로 분석해 cancer-associated epigenetic pattern을 찾습니다.

대표적인 분석 개념은

cfDNA Extraction

→ 5hmC Recognition 또는 Selective Labeling

→ 5hmC-Containing Fragment Enrichment

→ Sequencing

→ Genome-Wide Distribution Analysis

→ Biomarker Signature Evaluation

으로 정리할 수 있습니다.

5hmC를 분석할 때 가장 중요한 점은 conventional DNA methylation과 동일하게 취급하지 않는 것입니다.

일반적인 bisulfite 분석에서는 5mC와 5hmC가 직접 구별되지 않을 수 있으므로 5hmC-specific chemical·enzymatic strategy가 필요합니다.

또한 암 환자에서 특정 5hmC pattern이 관찰됐다는 사실만으로 임상진단 marker가 확립된 것은 아닙니다.

Sample preparation과 cfDNA recovery, 5hmC labeling efficiency, sequencing bias, 환자군 구성과 independent validation까지 함께 검토해야 합니다.

결국 5hmC liquid biopsy의 핵심은 DNA sequence가 변했는지만 찾는 것이 아니라 같은 DNA 위에 남아 있는 hydroxymethylation이라는 화학적 표지를 읽어 원래 세포의 epigenetic 상태와 질환 관련 변화를 추적한다는 것입니다.

이러한 접근은 mutation, methylation, fragmentomics와 함께 cfDNA 한 분자에서 얻을 수 있는 정보를 더 넓은 차원으로 확장하는 액체생검 연구 분야라고 볼 수 있습니다.

※ 본 글은 5-Hydroxymethylcytosine과 cfDNA 기반 액체생검 연구의 원리를 설명하기 위한 교육 목적의 콘텐츠입니다. 연구에서 보고된 5hmC signature를 특정 암을 확진하거나 일반인을 선별하는 확립된 임상검사로 해석해서는 안 됩니다.