DNA Tetrahedron 기반 바이오센서를 이용한 miRNA 검출 기술

DNA Tetrahedron은 여러 DNA strand의 상보적 결합으로 만드는 나노미터 크기의 3차원 DNA 구조입니다. 전극 위에 probe를 무작위로 배열하는 대신 일정한 공간 구조로 배치할 수 있어 miRNA를 검출하는 electrochemical biosensor 등에 활용되고 있습니다.

DNA Tetrahedron은 무엇일까?

DNA는 유전정보를 저장하는 물질이지만 sequence를 정밀하게 설계하면 원하는 nanoscale structure를 만들 수 있습니다.

DNA nanotechnology에서는 이러한 특성을 이용해 선형 구조뿐 아니라 triangle, cube, tetrahedron과 같은 다양한 구조체를 제작합니다.

그중 DNA Tetrahedron은 네 개의 꼭짓점과 여섯 개의 변을 갖는 삼차원 구조입니다.

대표적인 tetrahedral DNA nanostructure는 여러 개의 single-stranded DNA를 서로 부분적으로 상보화하도록 설계해 self-assembly시킬 수 있습니다.

각 strand가 다른 strand의 특정 영역과 hybridization하면서 전체적으로 안정된 tetrahedral framework가 형성됩니다.

이 구조를 단순한 DNA 덩어리가 아니라 probe의 위치와 방향을 제어하는 nanoscale scaffold로 사용할 수 있다는 점이 바이오센서에서 중요합니다.

평면 DNA Probe와 무엇이 다를까?

전기화학 핵산 센서에서는 gold electrode 표면에 thiol-modified DNA probe를 직접 고정하는 방법이 널리 사용됩니다.

하지만 많은 probe를 표면에 직접 부착하면 각각의 DNA가 동일한 방향과 간격으로 배열된다고 보장하기 어렵습니다.

일부 probe는 눕거나 서로 얽힐 수 있습니다.

Probe density가 지나치게 높으면 target nucleic acid가 recognition sequence에 접근하기 어려워질 수도 있습니다.

DNA Tetrahedron을 이용하면 이 문제를 다른 방식으로 접근할 수 있습니다.

Tetrahedron의 일부 꼭짓점을 electrode에 고정하고 target-recognition probe를 구조체의 위쪽으로 돌출시키도록 설계할 수 있습니다.

그러면 recognition site를 electrode 표면에서 일정 거리 떨어진 위치에 제시할 수 있습니다.

Gold Electrode에 어떻게 고정할까?

DNA Tetrahedron 기반 electrochemical biosensor에서는 gold electrode가 자주 사용됩니다.

DNA strand의 특정 말단에 thiol group을 도입하면 gold와 sulfur 사이의 강한 상호작용을 이용해 구조체를 표면에 고정할 수 있습니다.

예를 들어 tetrahedron의 아래쪽을 구성하는 여러 vertex에 thiol-modified end를 배치할 수 있습니다.

Self-assembled tetrahedron을 gold surface와 반응시키면 여러 anchoring point를 통해 구조가 전극에 부착될 수 있습니다.

위쪽 vertex에는 target recognition probe를 배치할 수 있습니다.

따라서

Gold Electrode

→ Tetrahedral DNA Scaffold

→ Upward-Oriented Recognition Probe

와 같은 삼차원 sensor interface를 만들 수 있습니다.

왜 3차원 구조가 Target 접근에 도움이 될까?

표면에 직접 고정된 DNA probe는 electrode와 너무 가까이 위치할 수 있습니다.

Target miRNA가 접근하려면 surface 주변의 steric environment와 probe density의 영향을 받습니다.

DNA Tetrahedron은 recognition probe를 electrode에서 일정 거리 떨어진 위치에 배치할 수 있습니다.

Target binding site가 solution 쪽으로 노출되면 miRNA가 접근할 수 있는 공간을 확보하는 데 도움이 될 수 있습니다.

또한 tetrahedral framework의 크기와 구조가 probe 사이의 평균적인 공간 배치를 조절하는 역할을 할 수 있습니다.

따라서 센서의 성능은 단순히 probe를 많이 붙이는 것뿐 아니라 probe가 target을 만날 수 있는 형태로 배치되어 있는가에 영향을 받습니다.

miRNA 검출에 왜 관심을 받을까?

miRNA는 일반적으로 약 18~24 nucleotide 정도의 짧은 non-coding RNA입니다.

여러 biological process의 gene regulation에 관여하며 특정 miRNA의 발현 변화는 다양한 질환 연구에서 biomarker 후보로 조사되고 있습니다.

하지만 miRNA를 분석하기에는 몇 가지 어려움이 있습니다.

Sequence가 매우 짧습니다.

같은 family의 miRNA 사이에 한두 개 nucleotide만 다른 경우가 있습니다.

Sample에서 농도가 낮을 수 있습니다.

RNA이기 때문에 degradation에도 주의해야 합니다.

따라서 miRNA sensor에서는 높은 probe accessibility와 sequence discrimination, 충분한 signal generation을 동시에 확보하는 것이 중요합니다.

miRNA가 Tetrahedron에 직접 결합할 수 있다

가장 단순한 구조에서는 tetrahedron 위쪽에 miRNA와 상보적인 capture sequence를 배치할 수 있습니다.

Target miRNA가 존재하면 해당 sequence와 hybridization합니다.

즉,

DNA Tetrahedron

→ Capture Probe Presentation

→ Target miRNA Hybridization

이 일어납니다.

그러나 hybridization 자체는 매우 작은 molecular event입니다.

따라서 실제 biosensor에서는 이 변화를 electrochemical signal이나 fluorescence signal로 변환해야 합니다.

Electrochemical Detection과 잘 결합되는 이유

DNA Tetrahedron은 특히 electrochemical biosensor 연구에서 많이 활용됩니다.

Electrode 표면에 DNA nanostructure를 직접 배치할 수 있기 때문입니다.

Target binding이 일어나면 electrode 근처의 molecular structure, redox reporter 위치 또는 interfacial electron-transfer property가 변하도록 설계할 수 있습니다.

이를 전류나 impedance 변화로 측정할 수 있습니다.

따라서 기본 구조는

miRNA Recognition

→ DNA Structure Change 또는 Reporter Recruitment

→ Electrode Interface 변화

→ Electrical Signal

로 연결할 수 있습니다.

Methylene Blue Reporter를 사용할 수 있다

Nucleic acid electrochemical sensor에서 자주 사용되는 redox reporter 가운데 하나가 methylene blue(MB)입니다.

MB가 electrode에 가까이 위치하면 electron transfer가 비교적 효율적으로 일어날 수 있습니다.

반대로 target binding으로 DNA 구조가 변하면서 MB와 electrode 사이의 거리가 증가하면 electron-transfer efficiency가 감소할 수 있습니다.

반대 방향으로 설계할 수도 있습니다.

Target이 결합했을 때 MB가 electrode에 더 가까워져 current가 증가하도록 만들 수 있습니다.

따라서 중요한 것은 단순히 MB가 존재하는지가 아니라 target recognition이 redox reporter와 electrode 사이의 거리 또는 환경을 어떻게 바꾸도록 설계됐는가입니다.

Signal-On과 Signal-Off 방식이 모두 가능하다

Electrochemical DNA sensor는 target이 존재했을 때 signal이 증가하도록 만들 수도 있고 감소하도록 만들 수도 있습니다.

Target miRNA가 binding한 뒤 redox reporter가 electrode 가까이 이동하면 signal-on 구조가 가능합니다.

반대로 target binding으로 reporter가 electrode에서 멀어지면 signal-off 구조가 될 수 있습니다.

따라서 DNA Tetrahedron 자체가 특정 방향의 signal을 만드는 것은 아닙니다.

Tetrahedron은 recognition probe를 정돈된 구조로 배치하는 scaffold이며 실제 signal direction은 reporter architecture에 의해 결정됩니다.

Tetrahedron 자체가 Signal Amplification을 하는 것은 아니다

DNA Tetrahedron 기반 sensor를 설명할 때 중요한 구분입니다.

Tetrahedral structure를 electrode에 고정했다고 해서 target DNA나 miRNA가 자동으로 증폭되는 것은 아닙니다.

DNA Tetrahedron의 기본 역할은

Probe Organization

Surface Orientation

Spatial Control

Target Accessibility

등입니다.

따라서 낮은 농도의 miRNA를 검출하기 위해서는 별도의 amplification reaction을 결합할 수 있습니다.

즉, tetrahedron은 amplification enzyme이 아니라 nanostructured sensing interface로 보는 것이 정확합니다.

HCR과 결합하면 Signal을 확대할 수 있다

DNA Tetrahedron 위에서 target miRNA가 인식된 뒤 HCR을 시작하도록 설계할 수 있습니다.

예를 들어 target binding으로 HCR initiator가 노출되게 만들 수 있습니다.

Initiator는 H1 hairpin을 열고 H1은 다시 H2를 엽니다.

이 과정이 반복되면서 electrode 위에 긴 nicked DNA assembly가 형성됩니다.

전체적으로

miRNA Recognition

→ HCR Initiator Activation

→ H1/H2 Chain Assembly

→ 많은 Reporter 결합

→ Signal Amplification

이 가능합니다.

이 경우 tetrahedron은 target-recognition interface이고 HCR은 downstream amplification module입니다.

CHA와도 결합할 수 있다

Catalytic Hairpin Assembly를 downstream reaction으로 사용하는 것도 가능합니다.

Target miRNA가 catalyst로 작동하거나 target recognition을 통해 CHA initiator를 방출하도록 설계할 수 있습니다.

CHA가 진행되면 많은 H1-H2 complex가 생성됩니다.

이 product가 electrode surface에 포획되거나 redox reporter를 모집하도록 만들 수 있습니다.

따라서

Tetrahedron → Recognition

CHA → Signal Amplification

이라는 기능 분담이 가능합니다.

이처럼 DNA Tetrahedron의 장점은 특정 amplification method에 종속되지 않는다는 것입니다.

DNA Walker를 Tetrahedron과 연결할 수도 있다

DNA Walker와 DNA Tetrahedron은 서로 다른 개념이지만 결합할 수 있습니다.

Tetrahedron은 spatial scaffold이고 DNA Walker는 반복적으로 substrate를 처리하는 nanomachine입니다.

Target recognition이 walker를 활성화하고 tetrahedral DNA structure 또는 다른 surface structure가 reaction site를 제공하도록 설계할 수 있습니다.

반대로 tetrahedron을 electrode interface로 사용하고 solution에서 발생한 DNA Walker product를 포획하는 방식도 가능합니다.

따라서 두 기술은 경쟁 관계라기보다 서로 다른 기능을 담당하는 module로 결합할 수 있습니다.

Enzyme-Assisted Target Recycling도 적용할 수 있다

Target miRNA가 probe와 hybridization한 뒤 nuclease가 probe를 선택적으로 절단하도록 설계할 수 있습니다.

Probe가 절단되면 miRNA가 다시 release되어 다음 probe와 반응할 수 있습니다.

그러면 하나의 miRNA가 여러 cleavage event를 일으킬 수 있습니다.

DNA Tetrahedron 위에 이러한 probe를 배치하면 surface organization과 target recycling을 동시에 이용할 수 있습니다.

다만 사용하는 nuclease가 어떤 duplex를 인식하고 어느 strand를 절단하는지는 enzyme마다 다르므로 구체적인 assay에서는 해당 enzyme의 substrate specificity를 확인해야 합니다.

Single-Nucleotide 차이를 구별하는 데 도움이 될까?

miRNA family에는 sequence가 매우 유사한 member가 많습니다.

일부는 nucleotide 하나만 다를 수도 있습니다.

DNA probe와 target 사이에 mismatch가 존재하면 duplex stability와 hybridization kinetics가 변할 수 있습니다.

따라서 capture probe의 길이와 sequence, reaction temperature를 조절하면 single-nucleotide discrimination을 향상시킬 가능성이 있습니다.

DNA Tetrahedron은 probe accessibility를 개선하는 데 도움을 줄 수 있지만 tetrahedral shape 자체가 single-base specificity를 자동으로 만드는 것은 아닙니다.

실제 specificity는 recognition sequence와 assay condition에 의해 결정됩니다.

Probe Density를 정돈하는 것이 왜 중요할까?

Surface biosensor에서는 probe를 많이 고정하면 sensitivity가 계속 높아질 것처럼 생각할 수 있습니다.

하지만 probe가 지나치게 밀집하면 target이 각 probe 사이로 접근하기 어렵습니다.

Negative charge를 가진 nucleic acid가 좁은 영역에 많이 존재하면 electrostatic environment도 달라집니다.

DNA Tetrahedron을 이용하면 개별 recognition probe를 하나의 defined nanostructure 위에 배치할 수 있습니다.

따라서 단순한 random monolayer보다 probe spacing을 구조적으로 제어할 가능성이 있습니다.

이것이 tetrahedral DNA nanostructure가 sensor interface engineering에서 주목받는 이유입니다.

Tetrahedron의 크기도 중요하다

DNA Tetrahedron은 원하는 대로 무한히 크게 만들면 좋은 것이 아닙니다.

구조가 작으면 electrode에 많은 nanostructure를 배치할 수 있지만 target accessibility와 steric effect가 달라질 수 있습니다.

구조가 커지면 recognition site를 surface에서 더 멀리 배치할 수 있지만 surface density가 낮아질 수 있습니다.

또한 DNA strand가 길어질수록 synthesis cost와 folding complexity도 증가할 수 있습니다.

따라서 tetrahedron size는 target 크기와 signal mechanism, electrode architecture에 맞게 조절해야 합니다.

Self-Assembly가 제대로 됐는지 확인해야 한다

여러 DNA strand를 섞었다고 해서 모든 molecule이 완전한 tetrahedron을 형성한다고 가정해서는 안 됩니다.

잘못된 hybridization product나 incomplete structure가 존재할 수 있습니다.

연구에서는 gel electrophoresis와 같은 방법으로 assembly 상태를 확인하거나 구조적 특성을 분석할 수 있습니다.

Sensor 제작에서는 electrode에 고정하기 전 nanostructure formation의 reproducibility도 중요합니다.

Tetrahedron assembly efficiency가 batch마다 달라지면 sensor performance 역시 달라질 수 있기 때문입니다.

Surface Coverage도 Sensor 성능에 영향을 준다

Gold electrode 전체가 동일한 tetrahedron layer로 완벽하게 덮인다고 가정하기 어렵습니다.

Surface cleaning 상태와 immobilization condition, DNA concentration 및 incubation time에 따라 coverage가 달라질 수 있습니다.

일부 영역에서는 tetrahedron이 밀집하고 다른 영역에서는 비어 있을 수 있습니다.

이 차이는 electrochemical baseline과 target binding capacity에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 실제 sensor를 개발할 때는 DNA sequence 설계뿐 아니라 surface chemistry의 재현성도 중요한 변수입니다.

Fetal Bovine Serum 같은 복잡한 Matrix에서는 어떻게 될까?

Buffer에서 작동하는 DNA sensor가 실제 biological sample에서도 동일하게 작동한다고 보장할 수 없습니다.

Serum이나 plasma에는 많은 protein과 salt가 존재합니다.

Protein이 electrode surface에 흡착하면 target 접근이나 electron transfer를 방해할 수 있습니다.

Nuclease가 DNA nanostructure를 손상시킬 가능성도 있습니다.

또한 miRNA가 protein complex 또는 extracellular vesicle에 포함되어 있다면 free synthetic miRNA와 동일하게 probe에 접근하지 못할 수 있습니다.

따라서 실제 sample에서는 extraction과 pretreatment가 필요할 수 있습니다.

DNA Nanostructure는 Nuclease에 완전히 안전할까?

Tetrahedral DNA nanostructure가 선형 single-stranded DNA보다 특정 조건에서 nuclease degradation에 대한 안정성이 향상될 수 있다는 연구들이 있습니다.

하지만 이를 ‘DNA Tetrahedron은 nuclease에 분해되지 않는다’고 설명해서는 안 됩니다.

DNA로 만들어진 구조이므로 biological environment에서 degradation 가능성이 존재합니다.

구조의 안정성은 sequence, geometry, temperature, ionic condition과 nuclease 종류에 따라 달라질 수 있습니다.

따라서 장기간 biological sample과 접촉하는 sensor에서는 stability를 별도로 평가해야 합니다.

Fluorescence Sensor로도 사용할 수 있다

DNA Tetrahedron이 반드시 electrode에만 사용되는 것은 아닙니다.

Fluorophore와 quencher를 tetrahedron의 특정 위치에 배치하고 target binding에 의해 거리가 달라지도록 설계할 수도 있습니다.

Target miRNA가 probe와 결합하면서 tetrahedral structure 일부가 재배열되면 fluorescence가 변할 수 있습니다.

또는 target recognition 후 별도의 fluorescent amplification reaction이 시작되도록 할 수도 있습니다.

따라서 DNA Tetrahedron은 electrochemical, fluorescence 등 다양한 readout system과 결합 가능한 structural platform입니다.

세포 내부 miRNA 검출에도 연구된다

DNA nanostructure는 cell-based sensing 연구에도 활용됩니다.

Tetrahedral DNA nanostructure에 target-responsive probe를 포함시키고 세포 내부의 특정 miRNA와 반응하도록 설계하는 방식입니다.

Target miRNA가 존재하면 strand displacement나 구조 변화가 발생하면서 fluorescent signal을 만들 수 있습니다.

이러한 연구는 intracellular molecular imaging 가능성을 보여줍니다.

하지만 cultured cell에서 fluorescence를 관찰하는 연구와 환자 검체를 이용한 임상진단은 구분해야 합니다.

Cellular uptake, intracellular stability와 toxicity 등 별도의 검증이 필요하기 때문입니다.

Aptamer와 결합하면 Target 범위를 넓힐 수 있다

DNA Tetrahedron은 nucleic acid target만 인식해야 하는 것은 아닙니다.

특정 protein이나 small molecule에 결합하는 aptamer를 tetrahedron 위에 배치할 수 있습니다.

그러면 nanostructured interface를 이용해 protein biomarker recognition sensor를 설계할 수도 있습니다.

즉, tetrahedron은 target 자체를 결정하는 것이 아니라 recognition element를 원하는 공간에 배치하는 scaffold입니다.

어떤 probe를 올리느냐에 따라 분석 대상이 달라질 수 있습니다.

Multiplex miRNA Detection도 가능할까?

서로 다른 miRNA를 동시에 검출하려면 각 target에 대응하는 recognition probe와 구별 가능한 signal이 필요합니다.

Tetrahedral nanostructure에 여러 recognition domain을 배치하거나 서로 다른 tetrahedron population을 사용할 수 있습니다.

각 target을 서로 다른 redox reporter 또는 fluorescent reporter와 연결하면 multiplex detection을 설계할